【摘要】：植物絡(luò)合素(PCs)在生命有機體金屬離子平衡、解毒和轉(zhuǎn)運累積體系中扮演著重要角色并有著廣泛的應(yīng)用前景,對其編碼基因的挖掘及功能探究已成為生物學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點�？兹覆�(Tagetes patula L.)為萬壽菊屬一年生草本植物,在觀賞、園林綠化以及藥用等方面被廣泛應(yīng)用。本研究對孔雀草PCS基因cDNA全長克隆,揭示鎘脅迫下PCS基因的表達模式和功能,為探明孔雀草鎘脅迫的分子響應(yīng)機制提供理論依據(jù)。已取得研究結(jié)果如下:1.孔雀草PCS基因的克隆:通過同源引物擴增方法獲得一保守區(qū)序列,該序列長為311bp,BLAST發(fā)現(xiàn)該段保守序列跟苣買菜(Sonchus arvensis)(SaPCS1)和萵苣(Lactuca sativa)(LsPCS1)的相似性很高,達90%。以該保守序列設(shè)計引物,利用cDNA末端快速克隆(RACE)的技術(shù),對孔雀草PCS基因保守區(qū)序列分別進行3′RACE和5′RACE擴增,由此獲得3′端序列1401bpb和5′端序列568bp,利用MEGA6.0軟件對序列進行拼接,最終獲得雀草PCS基因全長cDNA序列,基因全長1970bp。對序列進行開放閱讀框(ORF)分析表明:基因編碼區(qū)長1764bp,編碼587個氨基酸。將該序列上傳至NCBI中并命名為孔雀草PCS1(TpPCS1)基因,登錄號為KY007159。2.孔雀草PCS基因的生物信息學(xué)分析:用DNAman軟件對TpPCS1基因進行生物信息學(xué)分析,結(jié)果顯示:TpPCS1基因全長1970bp,開放閱讀框(ORF)長度為1764bp,編碼587個氨基酸,N端含9個半胱氨酸(Cys),具有34個酶切位點;基因編碼蛋白分子量為65.23KDa,等電點為8.01,不穩(wěn)定系數(shù)為47.72,平均疏水性指數(shù)為-0.171,該蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白;基因編碼蛋白信號肽預(yù)測結(jié)構(gòu)顯示該蛋白不存在信號肽,不屬于分泌蛋白,且跨膜預(yù)測結(jié)果顯示該蛋白不存在跨膜區(qū),二者與功能域預(yù)測結(jié)果相符合,屬于植物絡(luò)合素合酶蛋白,功能為細(xì)胞內(nèi)重金屬鎘螯合劑;基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)顯示蛋白屬于mixed型,以螺旋和轉(zhuǎn)角為主,與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果比較,二者結(jié)果吻合;從系統(tǒng)進化樹中可以看出,TpPCS1基因在進化上與同屬植物苣買菜和萵苣關(guān)系較近。3.TpPCS1基因的表達分析:對不同Cd濃度脅迫TpPCS1基因相對表達量研究,以孔雀草18srRNA和萵苣β-actin mRNA做內(nèi)參,結(jié)果顯示:(1)相同鎘濃度脅迫下,根中TpPCS1基因表現(xiàn)出較高的表達量,葉和種子中TpPCS1基因表達量相對較低,產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能與不同器官對鎘的富集量有關(guān),通常情況下,根中的鎘含量較其他器官都高;(2)相同生長期,隨著鎘脅迫濃度的上升,植株根、莖、葉中TpPCS1基因的表達量均呈上升趨勢,而在種子中,TpPCS1基因的表達量呈下降趨勢;(3)同一器官,隨著鎘脅迫時間增長,根、莖中TpPCS1基因的表達量均表現(xiàn)上升趨勢,其中根中表現(xiàn)明顯,而在葉中TpPCS1基因的表達量在低濃度時表現(xiàn)出高表達,而高濃度時表達量有所減少。4.不同濃度鎘脅迫對孔雀草DNA甲基化的影響:利用甲基化敏感擴增多態(tài)性(MSAP)技術(shù),對不同濃度Cd脅迫下孔雀草基因組DNA甲基化變化情況進行分析研究,結(jié)果表明:經(jīng)0、50、250和500 mg·kg-1濃度Cd處理后,基因組MSAP比率分別為24%、30%、35%和41%,全甲基化率分別為20%、23%、25%和27%,這表明重金屬脅迫處理后,DNA總甲基化水平隨Cd濃度升高而呈上升變化趨勢;在DNA甲基化模式變化方面,50、250和500 mg·kg-1濃度脅迫下重新甲基化率分別為10%、10%和11%,重新甲基化為主要的甲基化變化模式。
【圖文】：

圖 1.1 PCs 分子結(jié)構(gòu)式（Clemens 等，2006）Fig.1.1 Molecular structural formula of PCs御重金屬毒性的一種重要物質(zhì)，，PCs 的積累是由金屬離子下所形成的。當(dāng)重金屬對植物處于毒親和力。PCs 作為重金屬平衡和解毒的一種途

圖 1.2 PCS 催化 PCs 的合成Fig.1.2 Synthesis of phytochelatins(PCs)by PCSCS 基因表達研究為了弄清 PCS 基因在重金屬脅迫環(huán)境下的表達情況及分子機理，實現(xiàn)增強耐受重金屬脅迫和植物修復(fù)的可能性，這些基因的挖掘和合成表達在應(yīng)對植
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2;S681.9

【參考文獻】

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本文編號：2655734