【摘要】：我國(guó)是世界上最大的蘋(píng)果生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó),但干旱和低溫制約著黃土高原產(chǎn)區(qū)蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。利用蘋(píng)果自身的基因資源,提高蘋(píng)果的抗旱、耐寒能力具有重要意義。本研究從蘋(píng)果品種‘金冠’中克隆到一個(gè)鋅指蛋白基因,將其命名為MdZFP2。通過(guò)序列分析、亞細(xì)胞定位和qRT-PCR等方法,對(duì)MdZFP2的序列特征、細(xì)胞定位和表達(dá)特性等進(jìn)行了探究,通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選出2個(gè)與MdZFP2互作的蛋白,并利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)驗(yàn)證了該互作。此外,通過(guò)獲得MdZFP2的干擾(RNAi)及過(guò)表達(dá)蘋(píng)果轉(zhuǎn)基因植物,對(duì)MdZFP2在響應(yīng)蘋(píng)果干旱和低溫脅迫時(shí)的功能進(jìn)行了初步探究。研究結(jié)果如下:1.本研究克隆到一個(gè)MdZFP2基因,位于5號(hào)染色體,開(kāi)放編碼閱讀框?yàn)?12 bp,編碼303個(gè)氨基酸,蛋白分子量大小為33.93 kD。序列分析表明MdZFP2具有保守的鋅指蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域DOF。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明MdZFP2定位于細(xì)胞核,屬于典型的轉(zhuǎn)錄因子。MdZFP2基因啟動(dòng)子上含有兩個(gè)響應(yīng)MeJA的順式作用元件和一個(gè)響應(yīng)ABA信號(hào)途徑的ABRE。2.組織特異性表達(dá)結(jié)果表明,MdZFP2在蘋(píng)果的根、莖、葉中均有不同程度的表達(dá),根系中MdZFP2表達(dá)量遠(yuǎn)高于莖和葉。MdZFP2響應(yīng)干旱和低溫脅迫,PEG處理6小時(shí)MdZFP2基因的表達(dá)量為處理前的6倍,自然干旱處理‘金冠’中的MdZFP2基因表達(dá)量隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而上升;而低溫抑制MdZFP2的表達(dá),4oC處理第12小時(shí)MdZFP2表達(dá)量降至最低,僅為處理0小時(shí)的0.17倍。除此之外MdZFP2也響應(yīng)茉莉酸JA、水楊酸SA激素處理,表達(dá)量隨兩種處理時(shí)間延長(zhǎng)而下降。3.構(gòu)建了MdZFP2-pGBKT7載體,發(fā)現(xiàn)MdZFP2蛋白具有自激活活性,經(jīng)過(guò)對(duì)其蛋白截?cái)嗪螳@得無(wú)自激活的片段MdZFP2-510aa-BD。用MdZFP2-510aa-BD片段作為誘餌篩選MdZFP2的互作蛋白,獲得了兩個(gè)候選蛋白MdMIEL1和MdSNF1β2,前者編碼一個(gè)RING型E3連接酶,后者則是構(gòu)成SnRK1磷酸化復(fù)合體的亞基之一。酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)證實(shí)了該蛋白互作。另外,通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)對(duì)MdZFP2下游靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)。4.構(gòu)建MdZFP2干擾和過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入蘋(píng)果組培苗GL-3,獲得了MdZFP2的RNAi和過(guò)表達(dá)植物。對(duì)RNAi轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果植物進(jìn)行長(zhǎng)期干旱處理,發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期干旱后MdZFP2 RNAi植物株高、莖粗、光合作用參數(shù)、地上部與地下部的導(dǎo)水率和生物量等顯著低于GL-3,表明MdZFP2 RNAi植物對(duì)長(zhǎng)期干旱處理更為敏感。隨后用葉片自然失水實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)RNAi植物的葉片失水率顯著高于GL-3,而過(guò)表達(dá)植株表現(xiàn)出相反的趨勢(shì)。由此得出結(jié)論,MdZFP2參與蘋(píng)果對(duì)干旱脅迫的響應(yīng),正調(diào)控蘋(píng)果的抗旱性。另外,通過(guò)離子滲透率實(shí)驗(yàn)探究低溫下RNAi轉(zhuǎn)基因蘋(píng)果植物葉片的耐寒性,發(fā)現(xiàn)在-4oC及-6oC時(shí),RNAi植物葉片的相對(duì)離子滲透率均顯著低于GL-3,表明MdZFP2 RNAi植物的耐寒性更強(qiáng)。
【圖文】：

圖 1-1 擬南芥中的冷信號(hào)感知和反應(yīng)通路（Guo et al. 2018）Figure 1-1 Cold signal perception and responsive pathway in Arabidopsis（Guo et al. 2018）.2.2 蘋(píng)果耐寒性研究進(jìn)展近年來(lái)，隨著擬南芥、水稻等作物低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的深入研究，，關(guān)于蘋(píng)果耐的分子機(jī)制的發(fā)掘得到顯著發(fā)展。對(duì)低溫脅迫的蘋(píng)果進(jìn)行的的非靶向差異凝膠電示有三種脫氫蛋白 MdDHN2、MdDHN4 和 MdDHN6 大量積累，其中 MdDHN2dDHN4 發(fā)生磷酸化，在蘋(píng)果應(yīng)對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)性中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Perttu et017）。蘋(píng)果中的一個(gè) E3 連接酶 MdSIZ1 在低溫脅迫下可將 MdMYB1 進(jìn)行 SUMO 化進(jìn)花青素的積累，提高果實(shí)抗寒性（Zhou et al. 2017）；MdNAC029 識(shí)別并結(jié)dCBF1 和 MdCBF4 的啟動(dòng)子，負(fù)調(diào)控蘋(píng)果耐寒性（An et al. 2018）；MdMYB88/1接調(diào)控冷誘導(dǎo)基因 MdCSP3 和 MdCCA1，MdCCA1 而非 MdCSP3 在冷脅迫下可以 MdCBF3 的表達(dá)。此外，MdMYB88/124 可以促進(jìn)花青素積累和 H2O2解毒作用增果耐寒性（Xie et al. 2018）。bZIP 型轉(zhuǎn)錄因子 HY5 在冷脅迫下上調(diào)表達(dá)，MdHY5 直接結(jié)合 MdCBF1 啟動(dòng)子上的 G-Box 負(fù)調(diào)控其表達(dá)，除此之外，MdHY5 也可以

第三章 結(jié)果與分析第三章 結(jié)果與分析3.1 MdZFP2 的克隆與啟動(dòng)子分析3.1.1 MdZFP2 的克隆與序列分析本實(shí)驗(yàn)以‘金冠’為材料，克隆出 912 bp 的序列，編碼 303 個(gè)氨基酸，蛋白分子量大小為 33.92 kD，根據(jù) NCBI 的預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)序列具有典型的 DOF 結(jié)構(gòu)域，屬于DOF 類鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，將其命名為 MdZFP2。將蛋白序列與桃、葡萄、楊樹(shù)、擬南芥、玉米等常見(jiàn)植物的鋅指蛋白序列比對(duì)，如圖 3-1 所示，MdZFP2 蛋白 N 端存在保守的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域 DOF。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S661.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 梁容;;澳大利亞:蘋(píng)果和梨新品種不斷增加[J];中國(guó)果業(yè)信息;2019年06期

2 劉軍;劉增功;李斐;;做細(xì)“紅度”文章 實(shí)現(xiàn)果業(yè)增效[J];果樹(shù)實(shí)用技術(shù)與信息;2018年12期

3 馮建文;吳亞維;宋莎;韓秀梅;;貴州山地蘋(píng)果高效栽培技術(shù)[J];農(nóng)技服務(wù);2018年06期

4 梁容;;智利:努力開(kāi)發(fā)蘋(píng)果新品種[J];中國(guó)果業(yè)信息;2016年12期

5 沈紹寧;沈興海;;迷你蘋(píng)果——Rocki[J];中國(guó)果業(yè)信息;2017年02期

6 周洲;;立陶宛蘋(píng)果中酚類物質(zhì)組成[J];中國(guó)果業(yè)信息;2017年03期

7 禾本;;新西蘭:擬研發(fā)預(yù)防糖尿病的蘋(píng)果[J];中國(guó)果業(yè)信息;2017年02期

8 梁容;;奧地利:蘋(píng)果庫(kù)存歷史最低[J];中國(guó)果業(yè)信息;2017年02期

9 童彤;;印度:澄清蘋(píng)果品種并無(wú)病蟲(chóng)害[J];中國(guó)果業(yè)信息;2017年03期

10 梁容;;波蘭:出現(xiàn)大規(guī)模蘋(píng)果供應(yīng)短缺[J];中國(guó)果業(yè)信息;2017年06期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 陳迎春;李明;秦棟;翟衡;;2個(gè)單果性狀蘋(píng)果品種花期內(nèi)源激素水平比較[A];第四屆全國(guó)果樹(shù)種質(zhì)資源研究與開(kāi)發(fā)利用學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2010年

2 王同坤;于鳳鳴;張新忠;馮書(shū)琴;李紅星;;蘋(píng)果品種的過(guò)氧化物酶同工酶[A];中國(guó)園藝學(xué)會(huì)首屆青年學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];1994年

3 劉桂森;李淑潔;;蘋(píng)果品種雜交親和力的測(cè)定[A];河北省果樹(shù)學(xué)會(huì)1978年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文選編[C];1978年

4 郭文川;郭康權(quán);朱新華;;介電特性在番茄和蘋(píng)果品種識(shí)別中的應(yīng)用[A];農(nóng)業(yè)機(jī)械化與新農(nóng)村建設(shè)——中國(guó)農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2006年

5 郭文川;郭康權(quán);朱新華;;介電特性在番茄和蘋(píng)果品種識(shí)別中的應(yīng)用[A];2006年中國(guó)機(jī)械工程學(xué)會(huì)年會(huì)暨中國(guó)工程院機(jī)械與運(yùn)載工程學(xué)部首屆年會(huì)論文集[C];2006年

6 孫海峰;戴洪義;;魯加系列蘋(píng)果品種加工適性的評(píng)價(jià)[A];2008園藝學(xué)進(jìn)展（第八輯）——中國(guó)園藝學(xué)會(huì)第八屆青年學(xué)術(shù)討論會(huì)暨現(xiàn)代園藝論壇論文集[C];2008年

7 周莎莎;戴洪義;;不同蘋(píng)果品種果汁褐變相關(guān)因素的研究[A];2008園藝學(xué)進(jìn)展（第八輯）——中國(guó)園藝學(xué)會(huì)第八屆青年學(xué)術(shù)討論會(huì)暨現(xiàn)代園藝論壇論文集[C];2008年

8 宋家清;董月蘭;;我國(guó)蘋(píng)果品種網(wǎng)絡(luò)科技文獻(xiàn)的計(jì)量學(xué)分析[A];現(xiàn)代果業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化示范區(qū)創(chuàng)建暨果樹(shù)優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)技術(shù)交流會(huì)論文匯編[C];2015年

9 張建閣;;河北省果樹(shù)學(xué)會(huì)關(guān)于蘋(píng)果品種發(fā)展布局的初步建議[A];河北省果樹(shù)學(xué)會(huì)第十二屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];1991年

10 林春桂;;定縣蘋(píng)果品種調(diào)查初報(bào)[A];河北省果樹(shù)學(xué)會(huì)第七屆、第八屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];1981年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 盧新智;我省引進(jìn)收集蘋(píng)果品種資源達(dá)135份[N];陜西日?qǐng)?bào);2019年

2 記者 吳莎莎 鄭棟 通訊員 張琳;陜西首次擁有國(guó)審自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)蘋(píng)果品種[N];陜西日?qǐng)?bào);2019年

3 記者 史俊斌 通訊員 張琳;好吃好看又好種 自主產(chǎn)權(quán)新蘋(píng)果品種陜西育成[N];科技日?qǐng)?bào);2019年

4 本報(bào)記者 康平 和茜;小蘋(píng)果變“脫貧果”[N];云南日?qǐng)?bào);2019年

5 本報(bào)記者 李麗穎;為高原蘋(píng)果注入“科技力”[N];農(nóng)民日?qǐng)?bào);2019年

6 張琳 王學(xué)鋒 蔣建科;讓農(nóng)民嘗到種蘋(píng)果甜頭[N];人民日?qǐng)?bào);2019年

7 本報(bào)記者 李晨;蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)如何“根深葉茂”[N];中國(guó)科學(xué)報(bào);2019年

8 本報(bào)記者 王延斌;天價(jià)!“一個(gè)”蘋(píng)果賣(mài)了1000萬(wàn)[N];科技日?qǐng)?bào);2019年

9 國(guó)家蘋(píng)果工程技術(shù)研究中心 楊杰;七大早熟蘋(píng)果市場(chǎng)分析[N];河北科技報(bào);2019年

10 記者 張建光;蘋(píng)果期貨年滿周歲 市場(chǎng)功能初步發(fā)揮[N];糧油市場(chǎng)報(bào);2018年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 楊靜靜;蘋(píng)果果糖激酶基因MdFRK2在調(diào)控糖代謝中的功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

2 段乃彬;栽培蘋(píng)果起源、演化及馴化機(jī)理的基因組學(xué)研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

3 徐佳寧;蘋(píng)果UPL基因家族及轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組響應(yīng)非生物脅迫的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

4 孫婷婷;蘋(píng)果MdNAT1和MdNAT7轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在響應(yīng)干旱和鹽脅迫中的功能分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

5 黃振宇;蘋(píng)果果實(shí)含糖量基因標(biāo)記開(kāi)發(fā)與優(yōu)質(zhì)抗病基因組選擇芯片的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2018年

6 夏雪;基于計(jì)算機(jī)視覺(jué)的蘋(píng)果樹(shù)果實(shí)探測(cè)與定位方法[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2018年

7 趙光遠(yuǎn);混濁蘋(píng)果汁的研制及其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的研究[D];江南大學(xué);2005年

8 張江紅;酚類物質(zhì)對(duì)蘋(píng)果的化感作用及重茬障礙影響機(jī)理的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

9 馬玉華;逆境脅迫對(duì)蘋(píng)果抗壞血酸代謝相關(guān)酶活性及基因表達(dá)的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

10 張雪梅;不同蘋(píng)果品種S基因交互作用的分子及生理學(xué)研究[D];河北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 柴毛毛;日糧中添加蘋(píng)果粕對(duì)育肥豬生長(zhǎng)性能、肉品質(zhì)及腸道健康的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

2 張?jiān)?蘋(píng)果新品種（系）組培苗脫毒體系的優(yōu)化[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

3 邊家楓;中壓電場(chǎng)處理對(duì)蘋(píng)果組織結(jié)構(gòu)破損和鮮榨汁品質(zhì)的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

4 全朋坤;基于可見(jiàn)/近紅外光譜的蘋(píng)果內(nèi)部多品質(zhì)參數(shù)一體化便攜式檢測(cè)設(shè)備研發(fā)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

5 宋雪娜;6個(gè)蘋(píng)果品種花期凍害調(diào)查及抗凍性分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

6 南玉玉;不同質(zhì)地蘋(píng)果品種果實(shí)采后組織結(jié)構(gòu)和生理變化的差異比較[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

7 呂祚森;噴施外源脫落酸對(duì)蘋(píng)果生長(zhǎng)發(fā)育和果實(shí)品質(zhì)的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

8 孫夢(mèng)潔;4種蘋(píng)果病毒病檢測(cè)及蘋(píng)果新品種脫毒快繁體系建立[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

9 田小敏;基于轉(zhuǎn)錄組水平的蘋(píng)果抗白粉病基因篩選與感病葉片生理指標(biāo)分析[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

10 孫建春;蘋(píng)果品種（系）脫毒原種苗獲得的關(guān)鍵環(huán)節(jié)及流程[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2019年

本文編號(hào)：2654841