【摘要】：我國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)國和消費國,但干旱和低溫制約著黃土高原產(chǎn)區(qū)蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。利用蘋果自身的基因資源,提高蘋果的抗旱、耐寒能力具有重要意義。本研究從蘋果品種‘金冠’中克隆到一個鋅指蛋白基因,將其命名為MdZFP2。通過序列分析、亞細胞定位和qRT-PCR等方法,對MdZFP2的序列特征、細胞定位和表達特性等進行了探究,通過酵母雙雜交技術(shù)篩選出2個與MdZFP2互作的蛋白,并利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補技術(shù)驗證了該互作。此外,通過獲得MdZFP2的干擾(RNAi)及過表達蘋果轉(zhuǎn)基因植物,對MdZFP2在響應(yīng)蘋果干旱和低溫脅迫時的功能進行了初步探究。研究結(jié)果如下:1.本研究克隆到一個MdZFP2基因,位于5號染色體,開放編碼閱讀框為912 bp,編碼303個氨基酸,蛋白分子量大小為33.93 kD。序列分析表明MdZFP2具有保守的鋅指蛋白DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域DOF。亞細胞定位結(jié)果表明MdZFP2定位于細胞核,屬于典型的轉(zhuǎn)錄因子。MdZFP2基因啟動子上含有兩個響應(yīng)MeJA的順式作用元件和一個響應(yīng)ABA信號途徑的ABRE。2.組織特異性表達結(jié)果表明,MdZFP2在蘋果的根、莖、葉中均有不同程度的表達,根系中MdZFP2表達量遠高于莖和葉。MdZFP2響應(yīng)干旱和低溫脅迫,PEG處理6小時MdZFP2基因的表達量為處理前的6倍,自然干旱處理‘金冠’中的MdZFP2基因表達量隨著處理時間延長而上升;而低溫抑制MdZFP2的表達,4oC處理第12小時MdZFP2表達量降至最低,僅為處理0小時的0.17倍。除此之外MdZFP2也響應(yīng)茉莉酸JA、水楊酸SA激素處理,表達量隨兩種處理時間延長而下降。3.構(gòu)建了MdZFP2-pGBKT7載體,發(fā)現(xiàn)MdZFP2蛋白具有自激活活性,經(jīng)過對其蛋白截斷后獲得無自激活的片段MdZFP2-510aa-BD。用MdZFP2-510aa-BD片段作為誘餌篩選MdZFP2的互作蛋白,獲得了兩個候選蛋白MdMIEL1和MdSNF1β2,前者編碼一個RING型E3連接酶,后者則是構(gòu)成SnRK1磷酸化復(fù)合體的亞基之一。酵母雙雜交和雙分子熒光互補技術(shù)證實了該蛋白互作。另外,通過染色質(zhì)免疫共沉淀實驗對MdZFP2下游靶基因進行了預(yù)測。4.構(gòu)建MdZFP2干擾和過表達載體并轉(zhuǎn)入蘋果組培苗GL-3,獲得了MdZFP2的RNAi和過表達植物。對RNAi轉(zhuǎn)基因蘋果植物進行長期干旱處理,發(fā)現(xiàn)長期干旱后MdZFP2 RNAi植物株高、莖粗、光合作用參數(shù)、地上部與地下部的導(dǎo)水率和生物量等顯著低于GL-3,表明MdZFP2 RNAi植物對長期干旱處理更為敏感。隨后用葉片自然失水實驗進行驗證,發(fā)現(xiàn)RNAi植物的葉片失水率顯著高于GL-3,而過表達植株表現(xiàn)出相反的趨勢。由此得出結(jié)論,MdZFP2參與蘋果對干旱脅迫的響應(yīng),正調(diào)控蘋果的抗旱性。另外,通過離子滲透率實驗探究低溫下RNAi轉(zhuǎn)基因蘋果植物葉片的耐寒性,發(fā)現(xiàn)在-4oC及-6oC時,RNAi植物葉片的相對離子滲透率均顯著低于GL-3,表明MdZFP2 RNAi植物的耐寒性更強。
【圖文】：

圖 1-1 擬南芥中的冷信號感知和反應(yīng)通路（Guo et al. 2018）Figure 1-1 Cold signal perception and responsive pathway in Arabidopsis（Guo et al. 2018）.2.2 蘋果耐寒性研究進展近年來，隨著擬南芥、水稻等作物低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的深入研究，，關(guān)于蘋果耐的分子機制的發(fā)掘得到顯著發(fā)展。對低溫脅迫的蘋果進行的的非靶向差異凝膠電示有三種脫氫蛋白 MdDHN2、MdDHN4 和 MdDHN6 大量積累，其中 MdDHN2dDHN4 發(fā)生磷酸化，在蘋果應(yīng)對低溫脅迫的適應(yīng)性中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Perttu et017）。蘋果中的一個 E3 連接酶 MdSIZ1 在低溫脅迫下可將 MdMYB1 進行 SUMO 化進花青素的積累，提高果實抗寒性（Zhou et al. 2017）；MdNAC029 識別并結(jié)dCBF1 和 MdCBF4 的啟動子，負調(diào)控蘋果耐寒性（An et al. 2018）；MdMYB88/1接調(diào)控冷誘導(dǎo)基因 MdCSP3 和 MdCCA1，MdCCA1 而非 MdCSP3 在冷脅迫下可以 MdCBF3 的表達。此外，MdMYB88/124 可以促進花青素積累和 H2O2解毒作用增果耐寒性（Xie et al. 2018）。bZIP 型轉(zhuǎn)錄因子 HY5 在冷脅迫下上調(diào)表達，MdHY5 直接結(jié)合 MdCBF1 啟動子上的 G-Box 負調(diào)控其表達，除此之外，MdHY5 也可以

第三章 結(jié)果與分析第三章 結(jié)果與分析3.1 MdZFP2 的克隆與啟動子分析3.1.1 MdZFP2 的克隆與序列分析本實驗以‘金冠’為材料，克隆出 912 bp 的序列，編碼 303 個氨基酸，蛋白分子量大小為 33.92 kD，根據(jù) NCBI 的預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)序列具有典型的 DOF 結(jié)構(gòu)域，屬于DOF 類鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，將其命名為 MdZFP2。將蛋白序列與桃、葡萄、楊樹、擬南芥、玉米等常見植物的鋅指蛋白序列比對，如圖 3-1 所示，MdZFP2 蛋白 N 端存在保守的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域 DOF。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S661.1

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本文編號：2654841