【摘要】：隨著蘋果生產(chǎn)中主要的栽培品種的不斷變化,導(dǎo)致蘋果輪紋病成為我國當(dāng)前蘋果生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的病害之一,使蘋果產(chǎn)業(yè)受到巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究利用人工接種蘋果輪紋病菌和田間自然發(fā)病調(diào)查相結(jié)合的方法鑒定主要品種的抗病性,并對抗病品種北之幸和感病品種禮泉短富利用SA進(jìn)行誘導(dǎo)處理,測定誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后以及品種間與抗性相關(guān)的一些酶活性變化。進(jìn)一步通過高通量RNA-Seq測序技術(shù),明確不同處理間與抗輪紋病相關(guān)的差異表達(dá)基因,對篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證,取得了如下研究結(jié)果:1.對中國農(nóng)科院鄭州果樹所蘋果資源圃中的190個(gè)蘋果品種進(jìn)行了蘋果抗輪紋病品種抗病性鑒定。(1)通過人工接種蘋果輪紋病菌,發(fā)現(xiàn)不同蘋果品種在不同程度上都感染了蘋果輪紋病菌,沒有免疫品種,但品種間抗性存在一定的差異。通過聚類分析,高抗品種有15個(gè),占7.89%;中抗品種有77個(gè),占40.53%;中感品種有80個(gè),占42.11%;而高感品種有18個(gè),占9.47%。(2)2012年,2013年連續(xù)兩年對田間種植的190個(gè)供試品種做田間自然發(fā)病調(diào)查。2012年高抗品種占大多數(shù),中感品種只有1個(gè)品種,即禮泉短富。在調(diào)查的190個(gè)供試品種中,有164個(gè)品種的病情指數(shù)都在30以下,占調(diào)查品種總數(shù)的86.32%,但禮泉短富病情指數(shù)超過了50。2013總體的抗病趨勢與2012年的基本一致,在抗病品種中早熟品種占的比例較高,感病品種大多為富士系列品種,只有北之幸、1996-1-1和秦冠3個(gè)高抗品種。2012年和2013年的調(diào)查結(jié)果中均無高感品種。通過人工接種結(jié)合田間自然發(fā)病調(diào)查篩選出在兩年的調(diào)查中都表現(xiàn)一致穩(wěn)定的高抗病性品種北之幸和感病品種禮泉短富。2.以抗病品種北之幸和感病品種禮泉短富為材料,對不同濃度SA處理的蘋果葉片進(jìn)行抗性相關(guān)酶活性的測定。結(jié)果表明,SA處理北之幸和禮泉短富后,均可使植株體內(nèi)低水平的PAL、POD、β-1,3-葡聚糖酶和PPO活性在短時(shí)間內(nèi)提高,且明顯高于對照植株體內(nèi)的酶活性。其中抗病品種北之幸的PAL活性較對照提高了1.36-2.73倍;POD活性提高了4.74-6.19倍;β-1,3-葡聚糖酶活性提高了1.71-2.04倍;PPO活性提高了1.88-2.32倍。而感病品種禮泉短富的PAL活性提高了1.32-1.70倍,高濃度處理的PAL活性上升較慢,在第11d達(dá)到最大值;POD活性上升速度也較北之幸慢,在第11d達(dá)到最大值,較對照升高了4.11-5.68倍;β-1,3-葡聚糖酶升高了1.53-1.82倍;而PPO活性上升比較早,在第7d達(dá)到最大值,較對照上升3.13-4.00倍。表明酶活性的增加在不同品種間存在差異,從PPO活性的測定結(jié)果中可以看出,在未經(jīng)SA處理的不同蘋果品種中,PPO活性本身就存在一定的差異,抗病品種較感病品種PPO活性高,即在輪紋病發(fā)生的初始階段,抗病品種就能很好的抵御病原菌的入侵。3.以抗病品種北之幸和感病品種禮泉短富為材料,對SA處理前后的蘋果樣品進(jìn)行RNA-Seq測序,分析蘋果不同品種在SA誘導(dǎo)過程中,同一基因型在誘導(dǎo)前后和不同基因型在誘導(dǎo)前或誘導(dǎo)后的差異基因表達(dá)變化,構(gòu)建了SA誘導(dǎo)不同抗輪紋病品種過程的數(shù)字表達(dá)譜。主要結(jié)果如下:(1)對北之幸和禮泉短富SA處理前后共4個(gè)樣品進(jìn)行Illumina測序,共得到35.30M reads。(2)將各樣品測序得到的reads與Unigene庫進(jìn)行比對,共得到差異表達(dá)基因2590個(gè),其中最大差異表達(dá)基因1382個(gè),最小差異基因150個(gè),共表達(dá)基因有9個(gè),分別是:MDP0000039357、MDP0000158474、MDP0000223968、MDP0000225361、MDP0000232908、MDP0000329063、MDP0000362305、MDP0000838695和MDP0000916403,在共表達(dá)的基因中MDP0000223968、MDP0000329063和MDP0000362305參與了防御機(jī)制和應(yīng)答刺激。(3)在抗病品種北之幸處理組與對照組中,差異表達(dá)基因有257個(gè),213個(gè)上調(diào)表達(dá),44個(gè)下調(diào)表達(dá)。在感病品種禮泉短富處理組與對照組中,差異表達(dá)基因有150個(gè),有110個(gè)上調(diào)表達(dá),40個(gè)下調(diào)表達(dá)。在抗病品種北之幸處理組與感病品種禮泉短富處理組中,差異表達(dá)基因有828個(gè),有356個(gè)上調(diào)表達(dá),472個(gè)下調(diào)表達(dá)。而在抗病品種北之幸處理組與感病品種禮泉短富未處理組中,差異表達(dá)基因數(shù)目最多,有1382個(gè),540個(gè)上調(diào)表達(dá),842個(gè)下調(diào)表達(dá)。從結(jié)果中可以看出,在同一品種中,SA處理前后差異表達(dá)基因中上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目多于下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目,而不同品種間的差異表達(dá)基因數(shù)目則是最多,且多于同一品種處理前后的差異基因數(shù)目。(4)通過對生物信息學(xué)的注釋,共獲得2202條Unigene的注釋結(jié)果。差異基因數(shù)目最多的是整體功能類(General function prediction only),而與抗性相關(guān)的功能注釋主要涉及防御機(jī)制(Defense mechanisms)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制(Signal transduction mechanisms)、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)導(dǎo)(Energy production and conversion)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制(Inorganic ion transport and metabolism)。在感病品種禮泉短富中涉及防御機(jī)制的差異基因沒有注釋到。(5)對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋,主要參與的分類有:代謝過程(metabolic process)、應(yīng)答刺激(response to stimulus)、生物學(xué)調(diào)控(biological regulation)、免疫系統(tǒng)過程(immune system process)和抗氧化活性(antioxidant activity)。感病品種禮泉短富參與的顯著性功能GO分類種類少于抗病品種北之幸,且涉及到的差異表達(dá)基因數(shù)量也少于北之幸的。(6)對4個(gè)樣品可能涉及或參與的代謝通路進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,經(jīng)SA誘導(dǎo)處理后,不同品種間本身存在的差異表達(dá)基因數(shù)量明顯減少,但參與的顯著性功能GO分類和代謝通路數(shù)量變化不大,且涉及的范圍大致相同。主要涉及或參與的抗病相關(guān)代謝通路有:過氧化物酶體途徑(Peroxisome,ko04146)、苯丙烷生物合成途徑(Phenylpropanoid biosynthesis,ko00940)、萜類化合物生物合成途徑(Terpenoid backbone biosynthesis,ko00900)、植物與病原菌互作途徑(Plant-pathogen interaction,ko04626)、類黃酮生物合成途徑(Flavonoid biosynthesis,ko00941)、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(Plant hormone signal transduction,ko04075)、苯丙氨酸代謝途徑(Phenylalanine metabolism,ko00360)和核糖體途徑(Ribosome,ko03010)。品種間和品種內(nèi)的差別在于:在品種間參與的代謝途徑有核糖體途徑,沒有類黃酮生物合成途徑;而在品種內(nèi)參與的代謝途徑有類黃酮生物合成途徑,沒有核糖體途徑。且感病品種禮泉短富參與的代謝通路明顯少于抗病品種北之幸,而涉及到的與抗病相關(guān)的代謝通路則更少。SA誘導(dǎo)處理后,不同抗性品種所產(chǎn)生的差異基因數(shù)量明顯不同,抗性品種產(chǎn)生的差異基因數(shù)量多,感病品種產(chǎn)生的差異基因數(shù)量相對較少,且涉及到的代謝通路也少,這與品種間本身的抗病性有關(guān),同時(shí)也表明抗病品種的抗性相關(guān)基因更易受到SA的誘導(dǎo)。(7)在篩選到的2590個(gè)差異基因中,幾丁質(zhì)酶相關(guān)基因有304個(gè),其中有170個(gè)參與防御機(jī)制,120個(gè)基因與水楊酸應(yīng)答有關(guān);葡聚糖酶相關(guān)基因有39個(gè),其中有2個(gè)基因參與防御機(jī)制,2個(gè)基因參與苯丙烷代謝途徑,9個(gè)基因參與氧化還原途徑;有2個(gè)NPR1相關(guān)基因,一個(gè)GO注釋到參與防御機(jī)制;16個(gè)WRYK轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因,其中5個(gè)基因參與防御機(jī)制,4個(gè)基因與應(yīng)答刺激有關(guān);3個(gè)PR1相關(guān)基因均與防御機(jī)制有關(guān)和1個(gè)TGA相關(guān)基因。(8)與植物抗病相關(guān)的代謝途徑:苯丙烷氨類代謝途徑和水楊酸信號途徑中,都檢測到有差異基因的存在,在SA處理前后苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)和4-香豆酸-CoA連接酶(4CL)這3種酶基因不僅在抗病品種中存在差異表達(dá),在感病品種間也存在差異表達(dá)。對于類黃酮、木質(zhì)素、生物堿等具有抗菌活性的中間產(chǎn)物,在抗、感病品種間也存在差異表達(dá)。但在水楊酸信號途徑中,感病品種禮泉短富差異基因的表達(dá)量都較抗病品種北之幸的低。說明除了品種之間本身存在的差異外,外源施用SA更易誘導(dǎo)抗病品種中與水楊酸信號途徑相關(guān)的差異基因的表達(dá)量上調(diào)。(9)對6個(gè)共表達(dá)差異基因、1個(gè)葡聚糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和2個(gè)幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行Q-PCR驗(yàn)證,驗(yàn)證結(jié)果與RNA-Seq測序結(jié)果基本一致,僅在表達(dá)差異倍數(shù)上,兩者存在一定的偏差,但上下調(diào)表達(dá)趨勢基本相同。
【圖文】：

中性到性植處度 2才。中的 PAL 活性升高最快SA 處理感到最高值，較性在 11d 時(shí)植株，其體用 20mmo處理前期，度的升高，2.35 倍；而才達(dá)到最高活性較對照提快。感病品種禮較對照提高達(dá)到最高，體內(nèi)的 PAL 活ol/LSA 誘導(dǎo)兩品種體內(nèi)抗性品種北而感病品種高。SA 誘導(dǎo)提高了 1.36禮泉短富 7d高了 1.32-1.較對照提活性均逐漸導(dǎo)不同抗性內(nèi)的 PAL 活北之幸在處種禮泉短富被處理后，北6-2.73 倍，后，10mm46 倍。20m提高 1.7 倍。漸下降。性品種蘋果，活性相差不處理后 7d，被誘導(dǎo)后，北之幸體內(nèi)其中以 20mmol/L 和 15mmmol/LSA 誘隨著處理時(shí)，測定葉片不大，且隨處PAL 活性達(dá)PAL 活性升PAL 活性較mmol/L SAmmol/LSA 誘誘導(dǎo)的植株時(shí)間的延長片中 PAL 活處理時(shí)間的達(dá)到最高，升高較北之較禮泉短富誘導(dǎo)植株誘導(dǎo) PAL 株，葉片內(nèi)長，各濃度活性，結(jié)果的延長都有較感病品之幸慢，在富增長快且

3.2胞壁內(nèi)源發(fā)生.2 過氧化過氧化物壁中，，它可源活性氧清生了變化（（1）隨著化物酶(POD物酶在植物體可催化形成木清除劑。經(jīng) S圖 3.4、3.5著處理天數(shù)D)活性分體內(nèi)也參與木質(zhì)素以抵SA 處誘導(dǎo)5 和 3.6）。的延長，P39分析與抗病作用，抵御病原菌的理后，不同POD 活性迅是植物細(xì)胞的侵襲。PO同抗性品種迅速提升，不胞內(nèi)重要的OD 也是植蘋果體內(nèi)的不同抗性品的防御酶。在植物體內(nèi)重要的 POD 活性品種達(dá)到高峰在細(xì)要的性都峰的
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：S436.611.1

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