【摘要】：歐李是一種綜合利用價值極高的新型果樹資源,屬于薔薇科櫻桃屬樹種。含糖量是評價歐李果實品質(zhì)的主要指標之一,直接影響到果實的食用價值和商品價值,也是當前歐李育種重要的品質(zhì)指標。因此,對歐李果實糖積累生理和分子生物學機制的研究,可為提高果實品質(zhì)、加快育種進程提供理論依據(jù)。本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,分析了歐李果實發(fā)育過程中糖代謝相關(guān)基因的表達特性,研究了基因表達和糖代謝相關(guān)酶活性與糖積累之間的關(guān)系;利用基因克隆技術(shù),獲得12個糖代謝相關(guān)基因的全長CDS序列,并對它們的時空表達模式進行了分析;采用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草,探索歐李ChSPS1、ChSS1和ChSS3基因在蔗糖合成中的作用。主要研究結(jié)果如下:1.以歐李'農(nóng)大4號' 5個時期(花后80d、110d、117d、124d和131d)的果實為材料,測定了果實中可溶性糖含量的動態(tài)變化。結(jié)果表明:蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇和總糖含量隨著果實的生長發(fā)育呈穩(wěn)定增加的趨勢;在果實成熟期的蔗糖、葡萄糖、果糖和山梨醇含量分別.為:19.882mg·g-1FW(約占總糖含量的30%)、14.681 mg.g-1FW(約22%)、28.884mg·g-1FW(約44%)和2.364mg·g-1FW(約4%),說明該品種果實糖積累的主要形式是果糖。2.通過對歐李'農(nóng)大4號' 5個發(fā)育時期(4-1A、4-2A、4-3A、4-4A和4-5A)果實進行I11umina測序,5個時期測序結(jié)果注釋的序列數(shù)分別為26,870個、32,705個、32,745個、32,247個和31,228個,共找到27個與糖代謝相關(guān)基因的RPKM值,同時測定了果實中相關(guān)酶活性的動態(tài)變化。在歐李果實發(fā)育的前中期階段(花后11Od),SC、vAINV、NINV、SDH和FK的酶活性及相應(yīng)基因的表達水平較高,可溶性糖含量在這個時期均較低。隨著果實的生長發(fā)育,相應(yīng)的酶活性和基因表達降低,可溶性糖在這個階段開始在液泡中積累。在果實成熟的最后兩周,HT基因的表達上調(diào),果糖和葡萄糖進入液泡積累起來;SPS和SS酶活性及相應(yīng)基因表達水平升高,加快蔗糖的積累;可溶性總糖含量升高,果實的甜度增加。3.根據(jù)27個糖代謝基因的RPKM值,從中篩選出大量表達的12個基因,分別為:ChSPS1、ChSPS2、ChSS1、ChSS3、ChvAINV、ChNINV3、ChCWINV、ChHK1、ChFK2、ChSDH2、ChSUT4和ChSORT2。和利用序列組裝的方法從轉(zhuǎn)錄組測序信息中獲得它們的全長拼接序列,并設(shè)計引物。以歐李'農(nóng)大4號'成熟期(花后124d)果實為材料,通過基因克隆的方法獲得上述基因全長。ChSPSI基因編碼1057個氨基酸,ChSPS2基因編碼1059個氨基酸,ChSS1基因編碼806個氨基酸,ChSS3基因編碼640個氨基酸,ChvAINV基因編碼686個氨基酸,ChNINV3基因序編碼680個氨基酸,ChCWINV基因編碼557個氨基酸,ChHK1基因序編碼498個氨基酸,ChFK2基因編碼555個氦基酸,ChSDH2基因編碼367個氨基酸,ChSUT4基因編碼499個氨基酸,ChSOT2基因編碼538個氨基酸。進化樹分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要與櫻桃、杏、李、桃、蘋果、梨等薔薇科樹種具有較近的親緣關(guān)系。4.以歐李'農(nóng)大4號'的根、莖、葉、花和果實及果實的5個生長發(fā)育期為材料,利用熒光定量PCR技術(shù)對12個糖代謝相關(guān)基因的時空表達模式進行了分析,結(jié)果表明:這些基因在不同組織均有表達,存在空間表達特異性;它們在歐李果實生長發(fā)育不同階段的熒光定量結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致,說明轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量高。5.轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中共發(fā)現(xiàn)3個ChSPS基因,ChSPS1的RPKM值最大,說明它在歐李果實的蔗糖合成中起主要作用;ChSS1和ChSS3基因的RPK]M值隨果實蔗糖的積累呈相反的趨勢。為進一步驗證ChSPS1、ChSS1和ChSS3在歐李蔗糖合成中的作用,本研究成功構(gòu)建了 3個過表達載體:pBI-ChSPS1、pBI-ChSS1和pBI-ChSS3,以及分別以ChSS1和ChSSS3為靶基因的2個RNAi干擾載體:pBI-ChSS1-RNAi和pBI-ChSS3-RNAi。6.通過農(nóng)桿菌介導法將3個過表達載體轉(zhuǎn)入煙草,經(jīng)抗性篩選、PCR鑒定及GUS染色獲得轉(zhuǎn)化株系。ChSPS1基因在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的相對表達量是對照的1624-4626倍,轉(zhuǎn)基因煙草葉片中SPS酶活性升高為對照的1.15-1.55倍,蔗糖和總糖含量分別比對照增加了 0.353-0.876 mg.g-1FW 和 2.169-2.577 mg·g-1FW,可見ChSPS 基因在煙草葉片中促進蔗糖的積累。ChSS1在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的相對表達量是對照的2692-4829倍,轉(zhuǎn)基因煙草葉片中SS合成方向的酶活性升高為對照的1.10-1.26倍,蔗糖和總糖含量分別比對照增加了 0.489-0.768 mg.g-1FW和1.092-2.082 mg.g-1FW,可見ChSS1基因在煙草葉片中促進蔗糖的積累。ChSS3在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的相對表達量是對照的890-1979倍,轉(zhuǎn)基因煙草葉片中SS分解方向的酶活性升高為對照的1.37-1.94倍,蔗糖和總糖含量分別比對照降低了 0.625-0.958 mg.g-1FW和0.907-1.590 mg.g-1FW,可見ChSS3基因在煙草葉片中抑制蔗糖的積累。這些結(jié)果表明ChSS1和ChSS3在歐李果實蔗糖積累中起相反的作用。
【圖文】：

如在蘋果葉片光合作用的早期產(chǎn)物中，，山梨醇約占總糖的８０％。山梨醇也是逡逑一種可溶性的貯存類碳水化合物，其生物合成和分解代謝是由多種不同的酶催化進行的逡逑（圖１－２）邋［２３】：在薔薇科植物葉片的細胞質(zhì)中，葉綠體經(jīng)光合作用后生成的磷酸丙糖，逡逑在相關(guān)酶的催化作用下生成６－a愃峁牽ǎ疲恚悖簦錚螅澹叮穡瑁錚螅穡瑁幔簦澹澹疲叮校�，Ｆ６Ｐ有两种去蠞}哄義弦皇嗆銑桑叮璦愃崧固牽ǎ櫻酰悖潁錚螅澹叮穡瑁錚螅穡瑁幔簦�，讯Ｐ），进而生酬児虪繗g巧桑叮璦愃崞襄義咸煙牽ǎ牽歟酰悖錚螅澹叮穡瑁錚螅穡瑁幔簦澹牽叮校�，进而生晨樈缷z�。磦蝤哉r巨笨浦參鎦脅寺固清義蝦蛻嚼媧頰飭街植煌墓夂喜鐫聳湫問�。山缷z加梢鍍推げ吭聳淶焦檔瓤庾櫓義蝦螅瘓苯右栽紊繳嚼媧甲說鞍卓縋そ肟庀赴�，染忬转化芳堚为果糖或葡辶x咸煙

本文編號：2647092