【摘要】：本研究采集四川黃龍溝自然保護區(qū)西藏構(gòu)蘭(Cypripedium ribeticum),黃花杓蘭(Cypripedium flavum)和無苞杓蘭(Cypripedium bardolphianm)的根段。用徒手切片法觀察了3種杓蘭的菌根結(jié)構(gòu),并采用菌絲團懸浮液小塊培養(yǎng)基、菌根根段組織切塊和菌絲團懸浮液涂板3種方法分離根部內(nèi)生真菌,結(jié)合培養(yǎng)形態(tài)觀察和ITS區(qū)段的序列信息對分離到的菌株進行鑒定。通過物種集中性、Simpson多樣性指數(shù)和.Pielou均勻度指數(shù)計算三種杓蘭根部內(nèi)生真菌的多樣性。研究主要結(jié)果為:1.西藏杓蘭、黃花杓蘭和無苞杓蘭的根部內(nèi)生真菌通過根表皮的外皮層進入杓蘭屬植物根部,但沒有在中髓柱和維管束細胞區(qū)域觀察到菌絲侵入。2.菌絲團懸浮液小塊培養(yǎng)基分離法的分離效果優(yōu)于其它兩種方法。3.三種杓蘭根部分離得到10屬15株內(nèi)生真菌,其中以膠膜菌屬最多,占總體分離種類的33.3%。包括膠膜菌屬(Tulasnella)有5株,瘤菌根菌屬(Epulorhiza)1株,木霉屬(Trichoderma)2株,耙齒菌屬(Irpex)1株,碳團菌株(Hypoxylon)1株,赤霉菌屬(Gibberella)1株,鐮刀菌屬(Fusarium)1株,肉座菌屬(Hpocrea)1株,叢赤殼屬(Nectria)1株,黑團孢屬(Periconia)1株。分離得到的內(nèi)生真菌種類有差異性,造成這種差異性的原因可能是共生杓蘭生境不同和生長周期不同。4.黃花杓蘭根部內(nèi)生真菌的多樣性和均勻度在3種杓蘭中最高,其次是西藏杓蘭,最后是無苞杓蘭。說明在這一生長階段中黃花杓蘭適應(yīng)外界環(huán)境的能力優(yōu)于西藏杓蘭和無苞杓蘭。
【圖文】：

燒滅菌過的接種針挑取小塊培養(yǎng)基，迅速接入高壓滅菌的空培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿中逡逑放１０個小塊培養(yǎng)基，每個小塊培養(yǎng)基之間保持相對均勻距離，外側(cè)小塊培養(yǎng)基不要逡逑接觸到培養(yǎng)皿內(nèi)壁，直徑９邋ｃｍ的平板大約可以制作３０—４０個小塊培養(yǎng)基。（圖２－１邋）。逡逑圖２－１培養(yǎng)皿中的小塊培養(yǎng)基逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｓｍａｌｌ邋ｐｉｅｃｅｓ邋ｏｆ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｍｅｄｉｕｍ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｐｅｔｒｉ邋ｄｉｓｈ逡逑２．邋３．邋１．邋２菌絲團懸浮液的制備逡逑在超凈工作臺上，用酒精燈外焰灼燒滅菌過的鑷子將三種杓蘭菌根根段夾取到盛逡逑滿７５％酒精的無菌培養(yǎng)皿中，完全浸泡３０ｓ后，再用灼燒滅菌過的鑷子放入１％的逡逑ＮａＣＩＯ溶液中。浸泡３邋ｍｉｎ后夾出，再放入裝滿無菌水的培養(yǎng)皿中沖洗５—６次后，逡逑８逡逑

干燥的濾紙上，擦干根段表面水分。用灼燒滅菌過的手術(shù)刀將根段切成０．１邋—邋０．３邋ｃｍ逡逑的組織切塊，平鋪在２．３．２．１邋ＰＯＡ培養(yǎng)基平板上。每個培養(yǎng)基平板里按照五角形位置逡逑平鋪５個組織切塊（圖２－２）。記好分離信息后，放入２５邋°Ｃ培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。并以沒逡逑有加入根段組織切塊的ＰＯＡ培養(yǎng)基為對照組。每天觀察一次，一旦發(fā)現(xiàn)有菌絲從根逡逑段組織組織切塊邊緣長出，迅速在超凈工作臺上用灼燒滅菌過接種針挑取菌絲轉(zhuǎn)移到逡逑培養(yǎng)基平板上（配方見２．３．１．３）進行純化培養(yǎng)。并將剩余的ＰＯＡ培養(yǎng)基放回２５°Ｃ逡逑培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)觀察，重復(fù)上述試驗，直到?jīng)]有菌絲長出為止。分離得到菌絲重復(fù)逡逑純化過程，用ＰＤＡ培養(yǎng)基平板作為純化培養(yǎng)基，直到培養(yǎng)純化得到單一菌落，用ＰＤＡ逡逑斜面培養(yǎng)保存于４邋°Ｃ冰箱中，作為后續(xù)試驗的材料。逡逑■逡逑圖２－２根段組織切片逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｔｉｓｓｕｅ邋ｓｌｉｃｅ邋ｏｆ邋ｒｏｏｔ邋ｓｅｇｍｅｎｔｓ逡逑２．邋３．邋３菌絲團懸浮液涂板混勻分離法逡逑２．邋３．邋２．邋１分離培養(yǎng)基的制備逡逑配置馬鈴薯燕麥培基（ＰＯＡ），配方為新鮮去皮馬鈴薯５０克，燕麥８克，瓊脂逡逑１７克，蒸餾水１０００毫升，ｐＨ自然，高壓滅菌。冷卻到４６邋°Ｃ附近時，，按比例依次滴逡逑加入青霉素和鏈霉素
【學(xué)位授予單位】：北京林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：S682.31

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本文編號：2645254