【摘要】：黑莓(Rubusspp.)是應(yīng)用于園藝栽培生產(chǎn)的薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)植物之一,因果實(shí)成熟過(guò)程中經(jīng)歷綠色、紅色的變化,最后花青素苷(Anthocyanin)大量積累出現(xiàn)深紅色接近黑色而得名。黑莓果實(shí)中類黃酮物質(zhì)含量豐富,包括酚酸、原花青素(Proanthocyanidin,PA,也稱縮合單寧)和花青素苷等。其中原花青素在幼果中的含量可以超過(guò)40 mg/g鮮重(Fresh weight,FW),但隨著果實(shí)的成熟迅速減少,并且花青素苷逐漸積累;而黑莓果實(shí)的花青苷主要是矢車菊素-3-O-葡糖糖苷(Cyanidin-3-O-glucoside,Cy3G),含量超過(guò) 1.76mg/gFW;TT12 定位于液泡膜上,是多藥和有毒化合物排出家族(Multidrug and Toxic Compound Extrusion,MATE)成員之一,能特異地轉(zhuǎn)運(yùn)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷。同時(shí),編碼該蛋白的基因的突變能導(dǎo)致原花青素積累功能喪失。因此以富含花青素和原花青素的黑莓為試驗(yàn)材料研究TT12基因的功能,可以為利用基因工程技術(shù)對(duì)黑莓現(xiàn)有種質(zhì)進(jìn)行遺傳改良提供參考依據(jù)。本研究根據(jù)已登錄的黑莓轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已登陸的草莓、蘋(píng)果、碧桃等TT12同源基因設(shè)計(jì)引物,分離出RuTT12-1基因的全長(zhǎng),并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。構(gòu)建原核表達(dá)載體在大腸桿菌中對(duì)RuTT12-1進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體對(duì)RuTT12-1進(jìn)行功能分析。主要結(jié)果如下:(1)通過(guò)同源基因克隆的方法從黑莓果實(shí)中獲得了一個(gè)TT12基因的全長(zhǎng)cDNA,命名為RuTT12-1(Genbank登錄號(hào):KX130853)。該序列長(zhǎng)1659bp,包含一個(gè)1464 bp的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF),編碼487個(gè)氨基酸,推斷其編碼的蛋白的相對(duì)分子量(Molecular Weight,MW)為53.09 kDa,等電點(diǎn)(PI)為5.416,具有典型的MATE家族保守結(jié)構(gòu)域;跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示,該蛋白含有十二個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。(2)氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示,RuTT12-1與多個(gè)物種TT12基因編碼的蛋白具有較高的同源性,說(shuō)明TT12基因在進(jìn)化過(guò)程中較為保守。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明RuTT12-1與森林草莓FvTT12具有最高的同源性,達(dá)到87%。(3)密碼子偏好性分析顯示,RuTT12-1基因表達(dá)量不高,偏好使用以A/T結(jié)尾的密碼子,且7種最優(yōu)密碼子也均以A/T結(jié)尾。在密碼子的使用頻率上,RuTT12-1基因與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、煙草(Nicotianatobacum)的差異小于和玉米(Zeamays)、小麥(Triticum aestivum)的差異,因此擬南芥和煙草更適合作為該基因的異源表達(dá)宿主。通過(guò)與35種植物TT12基因密碼子偏好系數(shù)對(duì)比分析,大部分TT12基因偏愛(ài)使用以A/T結(jié)尾的密碼子,這可能與其功能有關(guān)。(4)成功構(gòu)建了 原核表達(dá)載體 pET-32a(+)-RuTT12-1 及 pEASY-Blunt E1-RuTT12-1,在大腸桿菌中采用不同IPTG濃度、不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同誘導(dǎo)溫度條件下誘導(dǎo)RuTT12-1基因的表達(dá),但均未能獲得理想的結(jié)果,可能是由于RuTT12-1跨膜蛋白的疏水性結(jié)構(gòu)過(guò)多,導(dǎo)致其在大腸桿菌中無(wú)法表達(dá)或表達(dá)過(guò)弱。成功構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA1301+-RuTT12-1。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301+-RuTT12-1重組質(zhì)粒到哥倫比亞野生型擬南芥中,使用潮霉素篩選出2株轉(zhuǎn)入目的基因的陽(yáng)性植株。與野生型擬南芥相比,轉(zhuǎn)目的基因擬南芥植株中花青素含量增加,原花青素含量降低,認(rèn)為黑莓RuTT12-1基因參與了花青素與原花青素的轉(zhuǎn)運(yùn)。
【圖文】：

圖２技術(shù)路線圖逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ邋ｒｏａｄｍａｐ逡逑

２．１．２n牛恚虻娜た寺″義弦院讞耘嗥分幀粒潁幔穡幔瑁鎩旃悖模危廖澹靡錚齲停旌停齲停步校校茫義義俠┰觶玫匠ぴ跡保叮埃板澹猓鸕奶醮ㄍ跡矗�。通过凝胶回叔帰连接转化、罈澭b呱稈�、菌辶x弦海校茫已櫓ぁ⒅柿Ｌ崛�、壹s懊蓋屑ǖ齲肯盜謝蚩寺〔街杌竦彌刈櫓柿＃粞″義先鼉ǖ陌裝嚦寺∽櫻淥橢遼蝦Ｉ錒こ逃邢薰窘脅廡頡ｅ義希灣澹卞義希齲繡義賢跡村澹遙裕校茫依┰齪讞罰罰罰餐椿蛉ゅ義獻(xiàn)ⅲ海停哄澹玻埃埃猓皰澹模危鈴澹蹋幔洌洌澹潁誨澹保閡镥澹齲停卞搴灣澹齲停插宓膩澹校茫義謇┰鰣義希疲椋紓澹村澹疲酰歟戾澹歟澹睿紓簦楨澹裕裕保插澹瑁錚恚錚歟錚紓錚酰簀澹紓澹睿邋澹悖歟錚睿澹溴澹媯潁錚礤澹猓歟幔悖耄猓澹潁潁澹悖觶粒潁幔穡幔瑁镥澹猓澹遙裕校茫義澹穡潁錚洌酰悖翦義希危錚簦澹哄澹停哄澹玻埃埃猓皰澹模危鈴澹蹋幔洌洌澹潁誨澹校茫義澹幔恚穡歟椋媯椋悖幔簦椋錚鑠澹鰨椋簦楨澹穡潁椋恚澹潁簀澹齲停戾澹幔睿溴澹齲停玻義希玻財(cái)悖罰罰罰玻虻納镅畔⒎治鰣義希玻玻卞澹�？ｖ嵙P裕罰玻蟣嗦氳陌被嶁蛄蟹治鰣義暇廡蚧竦貿(mào)ざ任保叮擔(dān)瑰澹猓皰澹ㄓ繕舷掠我錚齲停焙停齲停怖┰齙玫劍┑男蛄�。辶x暇危茫攏懾澹攏歟幔螅簦畏治觶�，这隔欜列即为鹤棶中ＡP裕粒駁耐椿蛐蛄�。利用ＤＮＡＭＡＮ辶x先砑治觶誦蛄脅喚靄肫鶚濟(jì)藶胱櫻粒裕嗆橢罩姑藶胱櫻裕牽粒保場(chǎng)停怠義隙耍眨裕乙舶諛�，薁苛P罰罰不蛉ば蛄校罰裕罰玻罰淇旁畝量蟈義銑ざ任保矗叮村澹猓穡嗦牒校矗福犯靄被岵謝牡鞍�。核苜~嶁蛄型蔥砸約鞍被徨義賢蔥運(yùn)得

本文編號(hào)：2639754