【摘要】：甜瓜(Cucumis melo L.)是一種有重要經濟價值和食用價值的作物,對甜瓜果實發(fā)育成熟分子機理的研究具有重要的理論意義和應用價值。本研究以甜瓜品種河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv Hetao)為材料,根據甜瓜果實轉錄組數據,選擇在果實不同發(fā)育時期有顯著差異表達的基因CmRGlase3和CmLWRKY48為候選基因,進行了生物信息學分析、克隆、表達譜和遺傳轉化研究,取得的主要結果如下:(1)甜瓜全基因組中鑒定得到RGlase基因家族共有7個成員,且該基因家族成員在進化上相對保守;RGlase基因家族和WRKY基因家族分別同黃瓜、番茄中的同種家族的成員,進行系統(tǒng)進化樹的構建,結果表明甜瓜和黃瓜屬于直系同源。對啟動子進行分析后發(fā)現,CmRGlase3包含o2-site(與蛋白質代謝相關的元件)、MSA-like(參與細胞周期調控的元件)和ABRE(參與脫落酸反應作用的順勢作用的元件);CmLWRKY48包含LTR(低溫響應作用元件)、ABR E(參與脫落酸反應作用的順式作用元件)和TCA-element(參與水楊酸反應作用的順式作用元件)。(2)應用RT-PCR技術擴增得到CmRGlase3基因和CmLWRKY48基因的cDNA序列,長度分別為1572 bp和1524 bp。通過實時熒光定量PCR分析結果表明,CmRGlase3基因在果實中的表達量明顯高于根、莖、葉中的表達量;而且在果實處于呼吸躍變期時表達量達到最大;CmLWRKY48基因在根、莖和葉中也有表達,其中在葉中的表達量較高;在果實中該基因的表達量同樣在呼吸躍變期時達到最大值。結果與轉錄組數據相符。(3)分別構建了CmRGlase3和CmLWRKY48基因的超表達載體和CRISPR/Cas9基因編輯載體,命名為pPRGlase3、pPWRKY48、pYL-RGlase3和pYL-WRKY48,采用子房注射法對甜瓜進行遺傳轉化。T_1代種子快速檢測的平均陽性率分別為10.23%、9.52%、8.75%和8.61%。在對T_1代果實表型的觀察中發(fā)現,實現CmRGlase3和CmLWRKY48基因超表達的T_1代果實都比對照組的果實更早成熟,分別平均比對照組提前6.2天和6.0天。初步研究結果表明,CmRGlase3和CmLWRKY48基因具有促進甜瓜果實成熟的作用。
【圖文】：

內蒙古大學學碩士學位論文行轉化，取連接產物 10.0 μL 于 1.5 mL 離心管中，放于冰水rans1-T1感受態(tài)細胞，立即放入冰水浴中，融化 2 min；融有連接產物的離心管中，液體打到離心管底部，吸打混勻后浴后，放入 42℃溫水中進行熱激，持續(xù) 30 s，注意放入溫水水浴中，計時 2 min；冰水浴結束后，超凈工作臺中給每個的 LB 液體培養(yǎng)基；然后放入 37℃的搖床中，180 rpm 培養(yǎng) 離心 2 min，吸棄上清液 600 μL，取 300 μL 菌液涂布于 LB 固，37℃過夜培養(yǎng)。載體的篩選R 方法進行初步篩選，陽性菌體的重組質粒再進行雙酶切驗證后將酶切驗證正確的菌株進行保菌，放于㧟80℃以備用。構e3 和 pPWRKY48。

圖 2.2 sgRNA 中間載體質粒圖譜[77]Fig.2.2 Physical Map of the sgRNA Intermediate PlasmidsCR——制備 sgRNA 表達盒，反應體系和反應條件為：5×PrimeSTAR GXL Buffer 5.0 μL，Pr0.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，，稀釋后的連接產物 3.0 μL，引2.0 μL，ddH2O 補足至 20.0 μL。反應條件：94℃ 預變性 5 m5 s，68℃延伸 30 s，30 個循環(huán)；68℃延伸補平 7 min。反應結。，以第一次 PCR 產物為模板，反應條件：5×PrimeSTAR GXL BL DNA Polymerase 1.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，引物對（2.0 μL，模板 1.0 μL，使用 ddH2O 補足至 50.0 μL。反應時不加性 5 min；98℃變性 10 s，58℃退火 15 s，68℃延伸 30 s，30
【學位授予單位】：內蒙古大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S652

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本文編號：2638285