發(fā)布時(shí)間：2020-04-23 23:40

【摘要】：甜瓜(Cucumis melo L.)是一種有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和食用價(jià)值的作物,對(duì)甜瓜果實(shí)發(fā)育成熟分子機(jī)理的研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究以甜瓜品種河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv Hetao)為材料,根據(jù)甜瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),選擇在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期有顯著差異表達(dá)的基因CmRGlase3和CmLWRKY48為候選基因,進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、克隆、表達(dá)譜和遺傳轉(zhuǎn)化研究,取得的主要結(jié)果如下:(1)甜瓜全基因組中鑒定得到RGlase基因家族共有7個(gè)成員,且該基因家族成員在進(jìn)化上相對(duì)保守;RGlase基因家族和WRKY基因家族分別同黃瓜、番茄中的同種家族的成員,進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建,結(jié)果表明甜瓜和黃瓜屬于直系同源。對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),CmRGlase3包含o2-site(與蛋白質(zhì)代謝相關(guān)的元件)、MSA-like(參與細(xì)胞周期調(diào)控的元件)和ABRE(參與脫落酸反應(yīng)作用的順勢作用的元件);CmLWRKY48包含LTR(低溫響應(yīng)作用元件)、ABR E(參與脫落酸反應(yīng)作用的順式作用元件)和TCA-element(參與水楊酸反應(yīng)作用的順式作用元件)。(2)應(yīng)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到CmRGlase3基因和CmLWRKY48基因的cDNA序列,長度分別為1572 bp和1524 bp。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明,CmRGlase3基因在果實(shí)中的表達(dá)量明顯高于根、莖、葉中的表達(dá)量;而且在果實(shí)處于呼吸躍變期時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大;CmLWRKY48基因在根、莖和葉中也有表達(dá),其中在葉中的表達(dá)量較高;在果實(shí)中該基因的表達(dá)量同樣在呼吸躍變期時(shí)達(dá)到最大值。結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相符。(3)分別構(gòu)建了CmRGlase3和CmLWRKY48基因的超表達(dá)載體和CRISPR/Cas9基因編輯載體,命名為pPRGlase3、pPWRKY48、pYL-RGlase3和pYL-WRKY48,采用子房注射法對(duì)甜瓜進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。T_1代種子快速檢測的平均陽性率分別為10.23%、9.52%、8.75%和8.61%。在對(duì)T_1代果實(shí)表型的觀察中發(fā)現(xiàn),實(shí)現(xiàn)CmRGlase3和CmLWRKY48基因超表達(dá)的T_1代果實(shí)都比對(duì)照組的果實(shí)更早成熟,分別平均比對(duì)照組提前6.2天和6.0天。初步研究結(jié)果表明,CmRGlase3和CmLWRKY48基因具有促進(jìn)甜瓜果實(shí)成熟的作用。
【圖文】：

內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)碩士學(xué)位論文行轉(zhuǎn)化，取連接產(chǎn)物 10.0 μL 于 1.5 mL 離心管中，放于冰水rans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，立即放入冰水浴中，融化 2 min；融有連接產(chǎn)物的離心管中，液體打到離心管底部，吸打混勻后浴后，放入 42℃溫水中進(jìn)行熱激，持續(xù) 30 s，注意放入溫水水浴中，計(jì)時(shí) 2 min；冰水浴結(jié)束后，超凈工作臺(tái)中給每個(gè)的 LB 液體培養(yǎng)基；然后放入 37℃的搖床中，180 rpm 培養(yǎng) 離心 2 min，吸棄上清液 600 μL，取 300 μL 菌液涂布于 LB 固，37℃過夜培養(yǎng)。載體的篩選R 方法進(jìn)行初步篩選，陽性菌體的重組質(zhì)粒再進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證后將酶切驗(yàn)證正確的菌株進(jìn)行保菌，放于㧟80℃以備用。構(gòu)e3 和 pPWRKY48。

圖 2.2 sgRNA 中間載體質(zhì)粒圖譜[77]Fig.2.2 Physical Map of the sgRNA Intermediate PlasmidsCR——制備 sgRNA 表達(dá)盒，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為：5×PrimeSTAR GXL Buffer 5.0 μL，Pr0.5 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，，稀釋后的連接產(chǎn)物 3.0 μL，引2.0 μL，ddH2O 補(bǔ)足至 20.0 μL。反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性 5 m5 s，68℃延伸 30 s，30 個(gè)循環(huán)；68℃延伸補(bǔ)平 7 min。反應(yīng)結(jié)。，以第一次 PCR 產(chǎn)物為模板，反應(yīng)條件：5×PrimeSTAR GXL BL DNA Polymerase 1.0 μL，dNTP Mixture 4.0 μL，引物對(duì)（2.0 μL，模板 1.0 μL，使用 ddH2O 補(bǔ)足至 50.0 μL。反應(yīng)時(shí)不加性 5 min；98℃變性 10 s，58℃退火 15 s，68℃延伸 30 s，30
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S652

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