【摘要】：藍果忍冬(Lonicera caerulea L.)具有極高的花色苷含量,是提取可食用天然色素的良好資源,更是極具發(fā)展?jié)摿Φ慕?jīng)濟保健型果實。藍果忍冬果實著色是花色苷積累的過程,bHLH蛋白是調(diào)控著花色苷生物合成的重要轉(zhuǎn)錄因子。然而,關(guān)于藍果忍冬花色苷合成的分子調(diào)控機理未見有研究報道。研究藍果忍冬花色苷合成的調(diào)控機制,既能為培育保健型植物品種提供理論基礎(chǔ),同時也可為植物抗逆分子機理的研究提供參考。本研究以藍果忍冬品種“蓓蕾”為材料,通過轉(zhuǎn)錄組測序、生物信息學(xué)分析、構(gòu)建LcTT8-EGFP綠色熒光載體和pBI121-LcTT8過表達載體、轉(zhuǎn)基因、亞細胞定位、實時熒光定量PCR、ELISA酶聯(lián)免疫吸附、pH示差法、高效液相色譜法(HPLC)等方法,篩選出了參與藍果忍冬果實花色苷生物合成的bHLH轉(zhuǎn)錄因子LcTT8,并進行了基因功能驗證。主要研究結(jié)果如下:(1)藍果忍冬bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定分析通過NCBI CDD、MEME方法結(jié)合藍果忍冬bHLH家族進化樹分析了藍果忍冬bHLH轉(zhuǎn)錄因子蛋白保守結(jié)構(gòu)域和保守基序進行鑒定,結(jié)果表明:有43個bHLH轉(zhuǎn)錄因子都包含bHLH家族保守結(jié)構(gòu)域HLH(PF00010)或bHLH-MYC_N(PF14215)。幾乎所有43個藍果忍冬bHLH蛋白都含有Motif 1或Motif 2,Motif 1和Motif 2共同構(gòu)成了藍果忍冬bHLH轉(zhuǎn)錄因子的basic helix-loop-helix保守結(jié)構(gòu)域。并且,研究結(jié)果表明,含有類似保守基序的bHLH轉(zhuǎn)錄因子之間具有更近的進化關(guān)系。(2)藍果忍冬花色苷生物合成相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子的篩選通過blastx將43條藍果忍冬bHLH家族序列比對到蛋白數(shù)據(jù)庫Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG(evalue0.00001),得到這些序列的蛋白功能注釋信息,結(jié)果表明:CL484.Contig3_All、Unigene21245_All、Unigene38564_All和Unigene7373_All與花色苷生物合成相關(guān)。將43條藍果忍冬bHLHs和225條擬南芥bHLHs合并構(gòu)建進化樹預(yù)測藍果忍冬轉(zhuǎn)錄因子的功能,結(jié)果表明:藍果忍冬bHLHs可分成14個亞族,CL484.Contig3_All和Unigene21245_All聚類在主要調(diào)控花色苷合成的Ⅲ f亞族。利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析了43個藍果忍冬bHLHs基因在不同組織部位、不同果實發(fā)育期的表達模式,結(jié)果表明:果實中的CL484.Contig3_All表達量顯著高于根、莖、葉、花;且當(dāng)果實發(fā)育到轉(zhuǎn)色期時CL484.Contig3_All表達量劇烈增高。最終篩選出藍果忍冬果實中調(diào)節(jié)花色苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子CL484.Contig3_All。(3)藍果忍冬TT8基因的克隆和生物信息學(xué)分析通過對藍果忍冬轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)裝配得到CL484.Contig3_All的CDs區(qū),命名為LcTT8。將LcTT8基因與克隆載體連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌測序,得到LcTT8核苷酸序列長度為2049bp。LcTT8蛋白質(zhì)為酸性蛋白(等電點pI為5.09),含有682個氨基酸,分子量為75928.12。預(yù)測LcTT8定位在細胞核,可能包含2個蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域,無信號肽位點。同時對LcTT8進行了蛋白三維結(jié)構(gòu)建模預(yù)測。將LcTT8與其他植物TT8進行多重序列比對,發(fā)現(xiàn)它們具有相似的保守序列。進化樹顯示藍果忍冬TT8和甜櫻桃(Prunus avium)TT8進化關(guān)系最近。(4)藍果忍冬TT8的亞細胞定位和基因表達分析利用擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法進行了亞細胞定位分析,在轉(zhuǎn)入空載體的擬南芥原生質(zhì)體中核、膜、質(zhì)均可見明亮的綠色熒光,而在轉(zhuǎn)入LcTT8-EGFP融合表達載體綠色熒光只富集在細胞核中。通過qRT-PCR分析LcTT8在藍果忍冬不同組織和不同果實時期的表達模式,結(jié)果發(fā)現(xiàn),LcTT8在根、莖、葉、花中表達量低,在果實中表達量極高,是其他部位的4-23倍;果實發(fā)育期間,LcTT8表達量先增后減,在果實轉(zhuǎn)色初期達到峰值。(5)藍果忍冬TT8基因的功能驗證構(gòu)建pBI121-LcTT8重組載體,利用煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系對LcTT8基因進行功能驗證,結(jié)果表明,LcTT8轉(zhuǎn)基因煙草的葉片、種皮顏色出現(xiàn)不同程度的加深。pH示差法測量花色苷含量發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因煙草葉片的花色苷含量上升。通過對LcTT8轉(zhuǎn)基因煙草葉片的花色苷合成基因CHS、CHI、F3H、DFR、ANS進行qRT-PCR分析,結(jié)果表明,相比野生煙草,LcTT8轉(zhuǎn)基因煙草葉片的F3H、DFR、ANS基因表達量大幅上調(diào)。檢測LcTT8轉(zhuǎn)基因煙草葉片花色苷合成相關(guān)酶活性,結(jié)果表明,LcTT8轉(zhuǎn)基因煙草的DFR、ANS酶活性上調(diào)最為明顯。通過花色苷含量檢測和HPLC分析花色苷組分,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因煙草葉片花色苷含量比野生煙草高,且主要是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷高于野生煙草。
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：S663.9

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本文編號：2629710