發(fā)布時(shí)間：2020-04-16 01:06

【摘要】：西瓜(Citrullus lanatus)作為重要的園藝作物,在世界各地廣泛栽培。但低溫脅迫嚴(yán)重影響了喜溫植物西瓜的反季節(jié)栽培,嚴(yán)重降低了西瓜的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。因此,研究西瓜耐低溫機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要的意義。多項(xiàng)研究表明,R2R3-MYB基因在多種植物響應(yīng)低溫脅迫過(guò)程中有重要的調(diào)控作用。在進(jìn)化方面,復(fù)制基因在家族基因成員擴(kuò)大和功能多樣性中起著重要的作用,在基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中扮演重要的角色。但R2R3-MYB復(fù)制基因是否具有調(diào)控西瓜低溫耐受性的作用,其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)如何,目前尚不清楚。因此,本研究通過(guò)對(duì)西瓜97103幼苗進(jìn)行低溫脅迫處理、觀察測(cè)定植株表型變化、生理響應(yīng)、并對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,鑒定西瓜R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族及其復(fù)制基因,篩選低溫脅迫下差異表達(dá)復(fù)制基因并進(jìn)行共表達(dá)分析,預(yù)測(cè)復(fù)制基因結(jié)合的下游互作順式元件并構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。主要研究結(jié)果如下:1.觀察西瓜幼苗低溫脅迫0 h與6 h,12 h,24 h,36 h及48 h幼苗表型變化,對(duì)丙二醛及過(guò)氧化物酶測(cè)定,發(fā)現(xiàn)隨著低溫處理時(shí)間的推遲,雖然植株有一定的恢復(fù)適應(yīng)能力,但長(zhǎng)期的低溫處理依舊會(huì)導(dǎo)致西瓜幼苗受到嚴(yán)重的低溫傷害。2.西瓜低溫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),0 h與6 h,12 h,24 h,36 h及48 h共同的差異表達(dá)基因有584個(gè),0 h與36 h之間的差異基因數(shù)量最多,與48 h之間的差異基因數(shù)量最少。西瓜全基因組在低溫脅迫時(shí)間序列處理下有10種不同的表達(dá)模式,其中有4種表達(dá)模式基因數(shù)量較多。差異基因GO富集在生物調(diào)控、生命代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程和對(duì)刺激的反應(yīng)等功能,KEGG分析發(fā)現(xiàn)低溫脅迫差異基因主要富集在代謝及次生代謝的生物合成等途徑中,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)差異基因參與激素信號(hào)傳導(dǎo)及晝夜節(jié)律等過(guò)程。3.全基因組共鑒定出西瓜R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子家族共有89個(gè)成員,包含48對(duì)R2R3-MYB復(fù)制基因。其中27對(duì)(56.25%)為片段復(fù)制基因?qū)?19對(duì)(39.58%)為轉(zhuǎn)座復(fù)制基因?qū)?1對(duì)近端復(fù)制基因?qū)?對(duì)串聯(lián)復(fù)制基因?qū)�。所有西瓜R2R3-MYB復(fù)制基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于1,表明其在進(jìn)化過(guò)程中均受到純化選擇。4.根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)僅有一對(duì)復(fù)制基因Cla005982-Cla005982(ClR2R3-MYB50和ClR2R3-MYB58)在低溫處理中兩個(gè)基因均為差異表達(dá)基因。通過(guò)共表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),目的基因ClR2R3-MYB50和ClR2R3-MYB58其表達(dá)模式相似,均在低溫脅迫后48 h有較高的表達(dá)量,ClR2R3-MYB58的共表達(dá)值較ClR2R3-MYB50高。GO富集分析及KEGG通路表明,同模塊中與2個(gè)基因相關(guān)性高的基因具有酶活性調(diào)控等功能,富集在代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物的生物合成等途徑中。5.篩選共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中與ClR2R3-MYB50、ClR2R3-MYB58相關(guān)性較高的基因啟動(dòng)子區(qū)域含有MBS元件的相關(guān)基因,構(gòu)建ClR2R3-MYB50和ClR2R3-MYB58在低溫下的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。下游預(yù)測(cè)分析與ClR2R3-MYB50和ClR2R3-MYB58結(jié)合的基因,發(fā)現(xiàn)Cla004399等基因可能參與膜脂不飽和程度的調(diào)控,在CBF等途徑中發(fā)揮作用。認(rèn)為ClR2R3-MYB50和ClR2R3-MYB58復(fù)制基因進(jìn)化后在低溫脅迫下保留功能,發(fā)揮相似的調(diào)控作用。
【圖文】：

（Zhu et al2014），突變?cè)诓煌恼{(diào)控區(qū)域可能導(dǎo)致表達(dá)水平的變化，在不同的編碼區(qū)域可能獲得新的功能（LongandThornton2001）。人們提出了許多進(jìn)化模型來(lái)闡明基因復(fù)制后的狀態(tài)機(jī)制，如圖 1-1 所示，包括短期和長(zhǎng)期的保留或失去功能（Qiao etal 2018）。其中，三種功能模型來(lái)描述保留的復(fù)制基因的功能，包括基因劑量效應(yīng)、亞功能化和新功能化（Flagel and Wendel 2009）�；騽┝渴峭ㄟ^(guò)改變復(fù)制后基因拷貝數(shù)而影響功能的機(jī)制之一，近年來(lái)的研究強(qiáng)調(diào)增加基因劑量可能有利于復(fù)制（Panchyet al2016）。亞功能化模型描述了在中性突變過(guò)程中，每個(gè)復(fù)制的基因保留了其原始的祖先功能（Freeling et al2015）。例如，擬南芥中，發(fā)現(xiàn)復(fù)制基因 ICARUS2和 ICARUS1 通過(guò)遺傳相互作用和分子進(jìn)化，使擬南芥更加適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境溫度（Belenet al2019）。在冷應(yīng)激反應(yīng)中，馬尾松（SolanumCommersonii）的 MYB 復(fù)制基因?qū)cAN2 和 ScAN1 之間存在亞功能化（D'Amelia et al 2017）。新功能化模型是指一個(gè)復(fù)制的基因保持了祖先原有的功能，而另一個(gè)基因獲得了新的功能（Duarte et al2006）。在花椰菜中 PFGLO1 和 PFDEF 兩個(gè)復(fù)制基因的 B 類 MADS-box 元件中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了新功能的現(xiàn)象（Zhang et al2015）。然而，在西瓜 R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族基因中，其復(fù)制的命運(yùn)、復(fù)制后表達(dá)功能等仍然是未知的。

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2019屆碩士研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文3.結(jié)果分析3.1西瓜幼苗低溫脅迫表型及冷害指數(shù)測(cè)定長(zhǎng)勢(shì)一致的 97103 西瓜幼苗經(jīng)過(guò) 10℃/5℃低溫脅迫處理之后，分別在 6 h，12h，24 h，36 h，48 h 觀察表型變化，如下圖 3-1 所示。低溫脅迫 6 h 之后，西瓜幼苗葉片明顯出現(xiàn)失水萎蔫狀態(tài)，葉片皺縮。處理 12 h 后，，西瓜幼苗葉片進(jìn)一步萎蔫，失水狀態(tài)較 6 h 葉片更為嚴(yán)重，真葉全部皺縮嚴(yán)重。處理 24 h 后，西瓜幼苗葉片基本恢復(fù)，葉片展開(kāi)，但植物狀態(tài)較 0 h 較差，葉片較軟。低溫處理 36 h 及 72h 后，西瓜幼苗再次出現(xiàn)萎蔫，葉片皺縮，葉片干裂皺縮，邊緣葉全部卷縮，葉片脆而弱，程度較 6 h 及 12 h 更為嚴(yán)重。整個(gè)低溫脅迫過(guò)程表現(xiàn)出一個(gè)萎蔫-恢復(fù)-萎蔫的過(guò)程。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：S651

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本文編號(hào)：2629210