【摘要】：線粒體是氧化還原代謝過程重要的細(xì)胞器,是細(xì)胞內(nèi)合成ATP與氧化磷酸化的主要場(chǎng)所。過氧化物酶(Prxs)是一種基于硫醇的家族過氧化物酶,在活性氧(ROS)和NO信號(hào)通路相互作用中扮演著重要角色。一氧化氮(NO)是復(fù)雜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中重要的分子,NO與活性氧(ROS)是應(yīng)激條件下誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分。目前對(duì)于NO與線粒體的研究主要集中于NO與線粒體呼吸、線粒體抗氧化系統(tǒng)等方面,而對(duì)線粒體氧化還原信號(hào)的影響鮮有報(bào)道。開展外源NO與冷信號(hào)對(duì)線粒體氧化還原信號(hào)相互作用的研究,有助于明確氧化還原代謝在果實(shí)采后貯藏的作用,以及NO與冷信號(hào)對(duì)線粒體氧化還原代謝的調(diào)控機(jī)理,對(duì)于維持果實(shí)采后品質(zhì),延長(zhǎng)果實(shí)采后貯藏時(shí)間具有重要的意義。為了深入研究2-Cys Prx基因調(diào)控桃果實(shí)氧化還原信號(hào)分子作用機(jī)制,本研究以肥城桃果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料,結(jié)合了PCR技術(shù)和RT-PCR等技術(shù)通過體外克隆的方法得到桃果實(shí)2-Cys Prx基因。對(duì)該序列分析,2-Cys Prx基因全長(zhǎng)1424 bp,其中編碼區(qū)813 bp,共編碼270個(gè)氨基酸,蛋白分子量為29.7 kDa。通過在線軟件對(duì)其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,2-Cys Prx蛋白分子式為C_(1342)H_(2110)N_(348)O_(403)S_4,理論等電點(diǎn)為6.23,為親水性膜外蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,肥城桃果實(shí)2-Cys Prx蛋白與櫻桃的親緣關(guān)系最近。體外構(gòu)建表達(dá)載體pET-30a-2-Cys Prx成功在大腸桿菌BL21中表達(dá)。外源NO對(duì)2-Cys Prx基因表達(dá)量的研究發(fā)現(xiàn),NO延緩了冷藏和常溫貯藏期間2-Cys Prx基因轉(zhuǎn)錄量的下降,而c-PTIO處理促進(jìn)了該基因轉(zhuǎn)錄量的下降。外源NO對(duì)線粒體內(nèi)源NO及氧化還原信號(hào)關(guān)鍵物質(zhì)的研究結(jié)果表明,外源NO提高了貯藏期間S-亞硝基谷胱甘肽還原酶(GSNOR)的活性,GSNOR活性的上調(diào)導(dǎo)致了S-亞硝基硫醇(RSNOs)的積累,因此桃果實(shí)線粒體內(nèi)源NO處于較低的水平。在對(duì)線粒體氧化還原信號(hào)關(guān)鍵物質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn),隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),外源NO降低了線粒體NAD(P)H的含量,增加了NAD(P)~+/NAD(P)H ratio,使桃果實(shí)線粒體氧化還原電勢(shì)處于較高水平,維持了氧化還原的平衡狀態(tài)。此外,外源NO能夠促進(jìn)桃果實(shí)線粒體ATP的產(chǎn)生,下調(diào)ADP/ATP ratio,保持線粒體能量在較高水平。對(duì)線粒體關(guān)鍵酶活Mn-SOD活性的測(cè)定發(fā)現(xiàn),NO降低了桃果實(shí)Mn-SOD活性,保護(hù)線粒體免受氧化應(yīng)激損傷。植物有自我調(diào)節(jié)抗冷機(jī)制、接受低溫刺激信號(hào)以抵御低溫的能力。本研究對(duì)不同溫度貯藏下線粒體氧化還原關(guān)鍵物質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn),冷藏條件線粒體內(nèi)源NO含量高于常溫條件。外源NO處理后,低溫冷藏降低了桃果實(shí)線粒體NAD~+/NADH ratio,提高了線粒體的能量水平,維持線粒體氧化還原的平衡,說明外源NO處理能夠有效減緩桃果實(shí)冷脅迫的影響。此外,冷藏條件下GSNOR活性維持在較高水平。結(jié)果表明外源NO與冷信號(hào)通過調(diào)控線粒體內(nèi)源NO含量、線粒體氧化還原信號(hào)關(guān)鍵物質(zhì)及能量水平來維持線粒體氧化還原平衡狀態(tài),進(jìn)而延緩細(xì)胞凋亡,延長(zhǎng)桃果實(shí)貯藏期。
【圖文】：

桃果實(shí)總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖 3 2-Cys Prx 溫度梯度 PCR 產(chǎn)物的 1% 瓊脂糖凝膠電泳圖1: Marker 2000; 2: 58.0 °C; 3: 57.5 °C; 4: 56.6 °C;5: 55.2 °C; 6: 53.5 °C; 7: 52.3 °C; 8: 51.4 °C; 9: 51.0 °C。 (w/v) agarose gel eletrophoresis of 2-Cys Prx gene temperature gradient PCR prod1: Marker 2000; 2: 58.0 °C; 3: 57.5 °C; 4: 56.6 °C;5: 55.2 °C; 6: 53.5 °C; 7: 52.3 °C; 8: 51.4 °C; 9: 51.0 °C。x 基因全長(zhǎng)的獲取
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S662.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2621085