【摘要】：葡萄風信子(Muscari spp.)是一種多年生單子葉植物球根花卉,因其花色主要為不同色系的藍色而著名,是研究單子葉植物花色形成的好材料�；ㄉ怯^賞植物的最重要性狀之一,花青苷是植物花色呈現(xiàn)的主要物質之一,目前對葡萄風信子的花色在轉錄調控方面的研究還尚不清楚。本研究在課題組前期葡萄風信子(Muscari armeniacum)轉錄組數(shù)據(jù)庫的基礎上,篩選出與花色形成相關的兩個R2R3-MYB和一個bHLH轉錄因子基因,首先對這些基因進行了克隆和基本特性分析;其次通過雙分子熒光互補(BiFC)試驗驗證了R2R3-MYB與bHLH轉錄因子互作;再通過雙熒光素酶試驗分析了MYB-bHLH復合物對花青苷合成途徑結構基因的調控作用;最后在煙草(N.tabacum‘NC89’)中研究了R2R3-MYB基因在調控花青苷合成中的功能,為揭示葡萄風信子花色形成的調控機制提供依據(jù),為葡萄風信子花色改良和分子育種提供有價值的基因。主要獲得了以下研究結果:(1)篩選克隆了兩個葡萄風信子花色相關R2R3-MYB轉錄因子基因MaMybA和MaAN2,對其基本特性進行了分析。從葡萄風信子轉錄組數(shù)據(jù)庫中篩選獲得了兩個與花青苷相關的R2R3-MYB unigenes,采用RACE方法獲得了cDNA全長,并分別命名為MaMybA和MaAN2。MaMybA cDNA全長778 bp,開放閱讀框(ORF)編碼237個氨基酸,GenBank登錄號為:MF663728。MaAN2 cDNA全長802 bp,ORF編碼240個氨基酸,GenBank登錄號為:KY781168。通過序列比對分析表明,MaMybA與MaAN2均在序列的N端高度保守,均含有雙子葉植物調控花青苷合成的R2R3-MYBs典型的保守氨基酸(R、V和A)和與R-like bHLH蛋白互作的保守基序([D/E]LX_2[R/K]X_3LX_6LX_3R);在其C端,含有與花青苷合成相關的特征基序([K/R]P[Q/R]P[Q/R])。若考慮氨基酸全長時,MaMybA和MaAN2的一致性僅為43.5%。聚類分析表明它們均屬于調控花青苷合成的R2R3-MYB轉錄因子家族的AN2亞組,但分支不同。它們均定位于細胞核中,在酵母中具有轉錄激活活性。MaMybA和MaAN2的轉錄表達具有組織特異性,在花中優(yōu)勢表達,且與花發(fā)育進程花青苷積累的變化趨勢相關,但MaMybA的表達稍比MaAN2提前。(2)篩選克隆了一個葡萄風信子花色相關bHLH轉錄因子基因MabHLH1,并通過BiFC試驗驗證了轉錄因子bHLHs與R2R3-MYBs互作。利用已知調控花青苷合成的bHLH蛋白通過本地BLASTP從葡萄風信子轉錄組數(shù)據(jù)庫中深度挖掘出一個與花青苷相關的bHLH unigene,采用RT-PCR方法克隆獲得了MabHLH1的cDNA。MabHLH1 ORF全長2001 bp,編碼666個氨基酸,GenBank登錄號為:MF663728。Mab HLH1在氨基酸序列的N端含有高度保守的MYB互作區(qū)域和在C端含有bHLH結構域。聚類分析表明MabHLH1聚類到bHLH轉錄因子家族Ⅲf亞組LC/JAF13/DEL簇。該轉錄因子定位于細胞核中,在酵母中具有轉錄激活活性。MabHLH1在葡萄風信子不同組織器官中組成型表達。Bi FC試驗驗證了MabHLH1和擬南芥調控花青苷合成的bHLH轉錄因子AtTT8均能分別與MaMybA和MaAN2在體內互作。(3)MaMybA或MaAN2與bHLH蛋白共表達,調控花青苷合成途徑晚期結構基因的表達。雙熒光素酶試驗結果表明,單獨表達35S:MaMybA不能激活花青苷合成途徑早期結構基因的啟動子,但能激活晚期結構基因MaDFR和MaANS啟動子;相較于單獨表達,35S:MaMybA與35S:MabHLH1或35S:AtTT8共表達,可輕微提高MaDFR和MaANS啟動子活性。單獨表達35S:MaAN2或35S:MabHLH1不能激活早期和晚期結構基因的啟動子;35S:MaAN2與35S:MabHLH1或35S:AtTT8共表達時,能明顯調控MaDFR和MaANS的表達。(4)MaMybA和MaAN2均能在煙草中調控花青苷合成,但花青苷積累強度和成分不同。通過農桿菌介導葉盤法在煙草‘NC89’中過量表達MaMybA(OE-MaMybA)和MaAN2(OE-MaAN2),可使煙草不同器官積累不同強度的花青苷。OE-MaMyb A煙草葉片、花冠和花冠筒、花藥、花絲、花萼呈深紫紅色,子房壁和種皮有少量花青苷積累;OE-MaAN2煙草葉片呈深紅色,花冠呈深粉紅色,花藥、花萼、子房壁和種皮呈深紅色。通過顯微觀察發(fā)現(xiàn),不同基因型煙草花青苷的細胞組織定位和表皮細胞形態(tài)無明顯差異。通過UPLC-Triple-TOF/MS方法鑒定,OE-MaMybA和OE-MaAN2煙草葉片和花冠中的花青苷成分不同。OE-MaMybA煙草葉片和花冠的花青苷組分主要有Cy3R和Dp3R,OE-MaAN2煙草葉片和花冠以及對照煙草花冠中花青苷組分主要為Cy3R,對照葉片中未檢測到花青苷。通過HPLC標準品定量的方法測定花青苷含量,結果表明,葉片和花冠的花青苷含量均在OE-MaMybA煙草中最高,在OE-MaAN2煙草中次之,在對照煙草中最低。實時定量PCR結果表明,OE-MaMybA和OE-MaAN2煙草葉片和花冠中幾乎所有花青苷代謝途徑結構基因以及內源bHLH基因都上調表達。值得注意的是,NtF3’5’H在OE-MaMybA煙草葉片和花冠中的轉錄本與對照和OE-MaAN2的相比明顯增加。因此,OE-MaMybA煙草之所以呈現(xiàn)出比OE-MaAN2煙草更深的顏色,主要是由于前者產生了以Dp3R為主的新花青苷和高濃度的花青苷含量。
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圖 1-1 花青苷代謝途徑示意圖早期結構基因 (EBGs) 編碼的酶用黃色矩形框表示，即 CHS：查爾酮合成酶，CHI：查爾酮異構酶，F(xiàn)3H：黃烷酮 3-羥化酶，F(xiàn)3’H：類黃酮 3’-羥化酶，F(xiàn)3’5’H：類黃酮 3’5’-羥化酶，，F(xiàn)LS：黃酮醇合成酶；晚期結構基因 (LBGs) 編碼的酶用粉紅色橢圓形表示，即 DFR：二氫黃酮醇 4-還原酶，ANS：花青素合成酶，UFGT：尿苷二磷酸：類黃酮糖基轉移酶，MT：甲基轉移酶，MYBs：MYB 轉錄因子，bHLHs：螺旋環(huán)螺旋蛋白，WDR：WD 重復蛋白。Figure 1-1 A schematic diagram of the flavonoid biosynthetic pathway leading to anthocyaninsThe early biosynthetic genes (EBGs) encoding enzymes shown in yellow rounded rectangle are as follows:CHS, chalcone synthase; CHI, chalcone isomerase; F3H, flavanone 3-hydroxylase; F3’H, flavonoid3’-hydroxylase; F3’5’H, flavonoid 3’5’-hydroxylase. FLS, flavonol synthase. The late biosynthetic genes(LBGs) encoding enzymes shown in pink oval are as follows: DFR, dihydroflavonol 4-reductase; ANS,anthocyanidin synthase; UFGT, uridine diphosphate: flavonoid glycosyltransferases; MT, methyltransferase; MYBs, MYB transcription factors; bHLHs, basic Helix-Loop-Helix proteins; WDR, WDrepeat protein.1.2 植物花色與花青苷廣義的花色是指整個花器官 (即花萼、正�；ò辍⑿廴�、雌蕊、苞片以及它們發(fā)育

將 MYB 家族轉錄因子分為 4 種類型 (圖1-2; Dubos et al. 2010; Du et al. 2012)：(1) 1R (R1/2, R3-MYB)，主要參與形態(tài)建成、次生代謝、生物鐘調節(jié)、生理脅迫響應以及花和果實的發(fā)育 (Feller et al. 2011)。(2) 2R(R2R3-MYB)，它們形成了植物 MYB 轉錄因子的最大亞家族。它們主要參與植物一級和次生代謝、決定細胞分化、激素信號轉導、調控植物生長發(fā)育以及響應生物和非生物脅迫 (Dubos et al. 2010)。(3) 3R (R1R2R3-MYB)，這類 MYB 轉錄因子主要存在于絕大多數(shù)真核生物基因組中，主要與細胞周期的調控有關 (Haga et al. 2007)。(4) 4R (含有 4個 R1/R2-like repeats)，對于它們的功能還不清楚 (Dubos et al. 2010)。
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S682.29

【引證文獻】

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1 金利妍;神農香菊（Chrysanthemum indicum var. aromaticum）CibHLH1基因克隆及其功能的初步研究[D];東北林業(yè)大學;2018年

2 孫璐;白樺BpMYB21和BpMYB61基因的克隆、表達特性及功能研究[D];東北林業(yè)大學;2018年

3 李想;彩葉芋‘紅桃K’遺傳轉化體系的優(yōu)化及AtPAP1基因與玉米Lc基因的導入[D];西南大學;2018年

4 李會萍;梁山慈竹DfNACs和DfMYB3基因功能的初步研究[D];西南科技大學;2018年

本文編號：2617618