【摘要】：近幾年,隨著甜瓜生產(chǎn)行業(yè)的發(fā)展,甜瓜雜交品種已被廣泛的應用于生產(chǎn)。然而,在人工種子生產(chǎn)過程中,如果隔離不嚴或者去雄不及時、不完全等,則易于形成自交種或者有其他假冒偽劣種子的混雜,導致雜種純度降低,使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)遭受嚴重的損失。為防止這種情況的發(fā)生,甜瓜雜種種子在包裝銷售前必須進行快速的純度鑒定。因此,研究薄皮甜瓜雜種純度快速鑒定的方法以及優(yōu)化和建立標準化流程體系十分重要,使其能更廣泛的應用于薄皮甜瓜種子市場監(jiān)測和品種的快速鑒定,為實際生產(chǎn)提供有效的參考。本研究使用SSR分子標記技術對薄皮甜瓜雜種品種進行種子純度的鑒定并建立了SSR標記技術標準化體系,試驗研究如下:1.本試驗以不同雜交種及其親本共31種薄皮甜瓜品種為試驗材料,從數(shù)據(jù)庫和相關文獻中選擇70對引物,通過對雜交種親本進行SSR-PCR擴增分析以及產(chǎn)物的檢測,篩選出了11對多態(tài)性豐富且穩(wěn)定性較好的核心引物。運用篩選得到的11對SSR多態(tài)性引物對甜瓜同母異父、同父異母雜交組合進行SSR分析,結(jié)果顯示,至少需要兩種或兩種以上的引物才能鑒別雜交種及其同母異父、同父異母雜交組合。研究表明,SSR引物組合法可用于鑒定薄皮甜瓜雜交種的純度,該方法能夠有效的檢測出雜交種中混有的自交系種子,并分辨出同母異父、同父異母雜交種,提高了雜種純度鑒定的準確度。2.本研究試驗材料為兩葉一心時的甜瓜真葉葉片,分別采用CTAB法和試劑盒法提取DNA并進行電泳檢測。結(jié)果顯示,兩種DNA提取方法都相對較穩(wěn)定、清晰,雜帶較少,均適用于SSR標記分析。但試劑盒法的擴增條帶比CTAB法的擴增條帶更為清晰,效果更加良好。分析并優(yōu)化了影響SSR標記穩(wěn)定性的幾個因素,如模板DNA含量、退火時間、循環(huán)次數(shù)、退火溫度、引物濃度等,確定了一套省時省力、經(jīng)濟有效的擴增程序,最終建立了一個具有良好的重復性、高清晰度、高分辨率的薄皮甜瓜標準化SSR-PCR擴增體系。反應體系:總體積為10μL,包括2μL體積模板DNA,濃度為100-200ng/μL,正反向引物各0.5μL-1μL,3μLmix(Taq DNA聚合酶、buffer和DNTP混合物)和3μL-4μL滅菌水。反應程序:預變性95℃,5min;95℃變性30s,退火55℃-58℃,40s,72℃延伸30s,35個循環(huán);72℃終延伸5min;20μL反應體系。3.本研究通過運用商品品種設計不同純度梯度雜種池進行雜種純度鑒定,來替代田間形態(tài)學純度鑒定驗證分子標記檢測純度的可靠性。結(jié)果顯示,該方法不僅能縮短純度鑒定驗證的時間和節(jié)省成本,而且也較為準確的顯示可以用來進行SSR分子標記可靠性的驗證。結(jié)果表明,不同純度雜種池法可以用來代替田間形態(tài)學鑒定雜種純度驗證SSR分子標記的可靠性,SSR分子標記純度鑒定技術可用于快速鑒定薄皮甜瓜雜種的純度和真實性。本試驗通過對建立的薄皮甜瓜雜種純度鑒定的SSR分子標記標準化體系的反復驗證。結(jié)果顯示,該體系擴增產(chǎn)物穩(wěn)定、重復性好、成本低,適合用于商業(yè)化的薄皮甜瓜雜種純度的鑒定。綜上所述,SSR引物組合法可以有效的提高雜種純度鑒定的準確性。合適的DNA提取方法,合理的模板DNA含量、退火時間、循環(huán)次數(shù)、退火溫度、引物濃度可以提高SSR標記擴增效果,提高清晰度和亮度,縮短時間。不同純度雜種池法可以代替田間形態(tài)學雜種純度鑒定法驗證SSR標記的可靠性,SSR分子標記可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的田間形態(tài)學雜種純度鑒定方法。本研究優(yōu)化并建立了一套經(jīng)濟、可靠、實用的SSR分子標記標準化鑒定體系,用于薄皮甜瓜雜交種純度的快速鑒定。
【圖文】：

圖 1 引物 GCM548、SSR12083、CMBR097 擴增 14 個親本的條帶圖譜注：親本：400，401，402，，403，404，406，407，408，412，413，419，420，425，R11Fig.1 Amplification of 14 parental bands by partial primers GCM548、SSR12083、CMBR097Note: Parents:400,401,402,403,404,406,407,408,412,413,419,420,425,R11

408 402 408×402 419 401 419×401 407 400 407×400 R11 400 R11×400圖 2 引物 CMGAN21、CMATN89、CM26、TJ10 對部分甜瓜雜交種擴增的條帶圖譜注：樣本：雜交組合分別為 408×402,419×401,407×400,R11×400Fig.2 Amplified band maps of partial melon hybrids with primers CMGAN21, CMATN89, CM26, andTJ10Note: Samples: Hybrid liness were 408×402,419×401,407×400andR11×400, respectively.
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S652

【參考文獻】

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本文編號：2613634