【摘要】：柑橘是世界第一大果樹,柑橘珠心胚特性是獨(dú)特的無融合生殖現(xiàn)象。這一現(xiàn)象一方面導(dǎo)致柑橘常規(guī)育種難以產(chǎn)生真正雜種,因此育種進(jìn)展緩慢。另一方面由于珠心苗的遺傳組成與母本一致,可以在柑橘生產(chǎn)砧木育種中廣泛利用,產(chǎn)生性狀整齊一致的后代。柑橘珠心胚形成的機(jī)理研究一直受到廣泛關(guān)注,前人對(duì)柑橘屬和枳屬的不同遺傳群體進(jìn)行了遺傳定位,但尚未鑒定到控制珠心胚性狀的候選基因。本研究利用特有的短童期材料山金柑(Fortunella hindsii),通過構(gòu)建雜交分離群體,并結(jié)合柑橘屬、枳屬雜交群體分析,定位控制珠心胚性狀的關(guān)鍵基因。利用特有的山金柑單胚和多胚材料,用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法對(duì)兩者胚珠進(jìn)行了差異基因挖掘,首次挖掘到柑橘珠心胚候選基因CitRWP,并對(duì)該基因進(jìn)行初步分析驗(yàn)證,同時(shí)開發(fā)了有效的分子標(biāo)記可以在柑橘屬中區(qū)分單胚和多胚品種。主要研究結(jié)果如下:1、多個(gè)遺傳群體鎖定控制柑橘珠心胚性狀的候選區(qū)域本研究利用短童期的山金柑種質(zhì)資源,以來源于廣東和福建的5個(gè)單胚山金柑為母本,以來源于江西的1個(gè)多胚山金柑為父本,創(chuàng)建了F1代分離群體,通過分子標(biāo)記檢測(cè)得到雜種共1321株,雜種率為95.24%。2015至2016年連續(xù)兩年對(duì)5個(gè)山金柑雜交群體的胚性進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)單胚和多胚的分離比均為1:1。將30個(gè)單胚和30個(gè)多胚的子代DNA分別進(jìn)行混池,利用BSA-seq法對(duì)混池進(jìn)行測(cè)序,將金柑屬珠心胚性狀鎖定到甜橙參考基因組4號(hào)染色體上特定位置。在山金柑分離群體中篩選到重組單株36個(gè),利用重組單株將金柑屬珠心胚性狀進(jìn)一步縮小到3.51MB-3.75MB區(qū)域內(nèi),該區(qū)域內(nèi)共35個(gè)基因,其中17個(gè)基因與共分離標(biāo)記連鎖。連續(xù)5年對(duì)HB柚(Citrus grandis)×Fairchild橘(C.reticulata×Citrus grandis)的雜交F1分離群體已結(jié)果的后代進(jìn)行表型分析,5年結(jié)果總計(jì)單胚后代66株,多胚后代58株,單胚和多胚的分離比例近似1:1。利用BSA-seq法對(duì)20個(gè)單胚子代和20個(gè)多胚子代分別進(jìn)行DNA混池分析,將控制珠心胚性狀的基因定位于4號(hào)染色體2.5Mb至3.9Mb區(qū)間。利用分子標(biāo)記對(duì)該位點(diǎn)在此群體中進(jìn)行了驗(yàn)證,并將候選定位區(qū)域縮短到480Kb內(nèi),該區(qū)域內(nèi)77個(gè)基因,同時(shí)也確認(rèn)控制金柑屬和柑橘屬多胚性狀基因處于同一個(gè)位點(diǎn),并與前人報(bào)道的區(qū)域相符。連續(xù)3年對(duì)兩個(gè)多胚材料紅橘(C.reticulata)×枳殼(Poncirus trifoliata)雜交F1群體進(jìn)行表型鑒定,共檢測(cè)到39株為多胚,28株為單胚,分離比例趨近2:1或1:1。將前面柑橘屬和金柑屬群體定位到的候選位點(diǎn)在該雜交群體中做了遺傳連鎖驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)有子代中有59株的表現(xiàn)型與該位點(diǎn)的基因型連鎖,但有8個(gè)多胚植株與該區(qū)段不連鎖,并發(fā)現(xiàn)該區(qū)段內(nèi)與性狀連鎖的標(biāo)記均來源于紅橘親本,而枳殼親本中雜合標(biāo)記在該區(qū)域并沒有連鎖現(xiàn)象,推測(cè)枳殼中可能存在其他控制位點(diǎn)。2、RNA高通量測(cè)序挖掘山金柑珠心胚起始發(fā)育相關(guān)基因山金柑有無融合生殖和有性生殖兩種類型,通過對(duì)無融合生殖起始發(fā)育時(shí)期進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察,確定花前胚囊單核時(shí)期和花后雙核胚囊時(shí)期為無融合生殖起始關(guān)鍵時(shí)期,對(duì)這兩個(gè)時(shí)期的胚珠進(jìn)行RNA高通量測(cè)序。通過denovo轉(zhuǎn)錄組分析,共獲得66,699個(gè)unigenes和156040個(gè)轉(zhuǎn)錄本,其平均長(zhǎng)度分別為1647bp和900bp。利用Nr,Nt和Swiss-Prot三個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)unigene進(jìn)行同源序列比對(duì),分別注釋3,665(35.48%),15,959(23.92%),18,267(27.39%)個(gè)unigene�；虿町惐磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn),珠心胚起始細(xì)胞開始出現(xiàn)的階段中,與單胚胚珠相比多胚胚珠有316個(gè)基因上調(diào)表達(dá),557個(gè)下調(diào)表達(dá);珠心胚起始細(xì)胞大量出現(xiàn)的階段中,多胚胚珠有532個(gè)基因上調(diào)表達(dá),541個(gè)下調(diào)表達(dá)。通過分析候選區(qū)域內(nèi)基因的表達(dá)差異發(fā)現(xiàn)CitRWP基因(comp57556_c0,Cs4g05960)可能為珠心胚發(fā)育的關(guān)鍵基因。此外,KEGG相關(guān)途徑分析顯示激素信號(hào)路徑有差異,差異基因中共檢測(cè)到25個(gè)差異表達(dá)基因與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)。從差異基因中隨機(jī)挑選20個(gè)基因進(jìn)行q PCR驗(yàn)證,結(jié)果表明RNA-seq數(shù)據(jù)可靠。3、柑橘無融合生殖候選基因CitRWP的功能分析和相關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā)應(yīng)用克隆了HB柚、Fairchild橘、克里曼丁橘、山金柑等品種的CitRWP基因,發(fā)現(xiàn)品種間僅有極少SNP差異。實(shí)時(shí)定量PCR分析表明,CitRWP在晚白柚(C.grandis cv.Wanbai)、枸櫞(C.medica)、克里曼丁橘(C.clementina)等單胚品種的胚珠中低表達(dá),但在Flame葡萄柚(C.paradisi cv.Flame)、檸檬(C.limon)、i*柑(C.reticulata cv.Ponkan)、伏令夏橙(C.sinensis cv.Valencia)等多胚品種中則高表達(dá);選取5個(gè)胚珠發(fā)育時(shí)期分析CitRWP表達(dá)水平,結(jié)果表明CitRWP隨著胚珠發(fā)育表達(dá)水平逐漸降低,在多胚山金柑中的表達(dá)水平顯著高于單胚。在HB×FC分離群體中,多胚胚珠中該基因的表達(dá)量是單胚中上百倍,并且多個(gè)時(shí)期結(jié)果一致。亞細(xì)胞定位表明該基因主要定位于在細(xì)胞核中,同時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中也有少量分布。進(jìn)化分析表明CitRWP不屬于擬南芥已報(bào)道的RKD家族,而與小立碗蘚Pp RWP3和Pp RWP4以及地錢Mp RWP1更為相近。多胚品種中CitRWP啟動(dòng)子區(qū)域存在一個(gè)特異插入的MITE轉(zhuǎn)座子。利用該轉(zhuǎn)座子開發(fā)出候選基因相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記mite_p1,并在786份柑橘屬種質(zhì)資源中進(jìn)行驗(yàn)證,證明該標(biāo)記與多胚性狀完全連鎖。此外,構(gòu)建了該基因超表達(dá)載體,在擬南芥中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化驗(yàn)證。
【圖文】：

6圖 1-1 無融合生殖與有性生殖相關(guān)概念（Rodriguezleal and Viellecalzada 2012)Sy，助細(xì)胞 (橙色)，EC, 卵細(xì)胞(藍(lán)色), CC 雙核中央細(xì)胞(粉色), An, 反足細(xì)胞(棕色). NEmb, 心胚，PEmb, 孤雌生殖. Tetrad, 四分體, 2NFG, 雙核未減數(shù)雌配子, AI, 無孢子生殖起始細(xì)胞Fig.1-1 Related concepts of apomix and amphimixis (adapted from Rodriguez-Leal)Sy, synergids (orange), EC, the egg cell(blue), CC binucleated central cell(pink), Aantipodals(brown). NEmb, nucellar embryos, PEmb, parthenogenesis (gametophytic pomixis). Tetrtetrad of haploid nuclei, 2NFG, 2-nuclear unreduced female gametophyte, AI, aposporous initial cel無孢子生殖無孢子生殖胚囊通常是從大孢子母細(xì)胞周圍的珠心組織分化而來的，其遺傳成與母體一致，也是未減數(shù)的。大孢子母細(xì)胞的合點(diǎn)端珠心細(xì)胞分裂旺盛，能夠化產(chǎn)生無孢子生殖胚囊，這些珠心細(xì)胞稱為無孢子生殖原始細(xì)胞(aposporous initcells，AI)，這些細(xì)胞通過有絲分裂產(chǎn)生未減數(shù)胚囊(Naumova and Willemse 1995)

第二年的授粉實(shí)驗(yàn)中，由于選用母本 PN1、PN2、PN3 花期較早，4 月就已開花，此時(shí)父本尚未進(jìn)入開花期，故使用上一年-20℃保存的花粉 DB02，通過萌發(fā)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)保存一年后的 DB02 花粉活率為 76.8%，花粉萌發(fā)活力為 22.3%，仍保持較高活力，可以用于雜交授粉。由于山金柑的自交親和性與不親和性未見報(bào)道，我們對(duì)雜交授粉和自交的花粉和柱頭做了親和性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)雜交和自交的花粉都能在山金柑柱頭上萌發(fā)，且在授粉 24 h 后就能萌發(fā)一定長(zhǎng)度（圖 2-2）2012 年 6 月-9 月進(jìn)行雜交授粉，3 個(gè)父本，12 個(gè)母本進(jìn)行雜交組合，授粉約3000 朵花，得到雜交種子約 500 顆，經(jīng)過試管播種、煉苗、移栽存活 271 棵。但由于此次雜交所得到的群體個(gè)數(shù)太少，，無法用于后期遺傳分析。我們于 2013 年 4 月-月再次對(duì)進(jìn)行山金柑進(jìn)行雜交授粉，以單胚山金柑 PN 系、LT 系為母本，父本為多胚山金柑 DB02，創(chuàng)建了 5 個(gè)雜交組合（圖 2-3，表 2-2）。將雜交種子去除種皮，30℃ 催芽長(zhǎng)出胚根后，播種于加溫溫室的苗床上，23-28℃育苗，大部分種子兩周內(nèi)以上破土萌發(fā)，待植株長(zhǎng)到 8-10 片葉后，定植于大育苗盆中共成苗 1387 棵。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：S666


本文編號(hào)：2612494