【摘要】：柑橘是世界第一大果樹,柑橘珠心胚特性是獨特的無融合生殖現(xiàn)象。這一現(xiàn)象一方面導致柑橘常規(guī)育種難以產(chǎn)生真正雜種,因此育種進展緩慢。另一方面由于珠心苗的遺傳組成與母本一致,可以在柑橘生產(chǎn)砧木育種中廣泛利用,產(chǎn)生性狀整齊一致的后代。柑橘珠心胚形成的機理研究一直受到廣泛關(guān)注,前人對柑橘屬和枳屬的不同遺傳群體進行了遺傳定位,但尚未鑒定到控制珠心胚性狀的候選基因。本研究利用特有的短童期材料山金柑(Fortunella hindsii),通過構(gòu)建雜交分離群體,并結(jié)合柑橘屬、枳屬雜交群體分析,定位控制珠心胚性狀的關(guān)鍵基因。利用特有的山金柑單胚和多胚材料,用轉(zhuǎn)錄組測序的方法對兩者胚珠進行了差異基因挖掘,首次挖掘到柑橘珠心胚候選基因CitRWP,并對該基因進行初步分析驗證,同時開發(fā)了有效的分子標記可以在柑橘屬中區(qū)分單胚和多胚品種。主要研究結(jié)果如下:1、多個遺傳群體鎖定控制柑橘珠心胚性狀的候選區(qū)域本研究利用短童期的山金柑種質(zhì)資源,以來源于廣東和福建的5個單胚山金柑為母本,以來源于江西的1個多胚山金柑為父本,創(chuàng)建了F1代分離群體,通過分子標記檢測得到雜種共1321株,雜種率為95.24%。2015至2016年連續(xù)兩年對5個山金柑雜交群體的胚性進行了分析,發(fā)現(xiàn)單胚和多胚的分離比均為1:1。將30個單胚和30個多胚的子代DNA分別進行混池,利用BSA-seq法對混池進行測序,將金柑屬珠心胚性狀鎖定到甜橙參考基因組4號染色體上特定位置。在山金柑分離群體中篩選到重組單株36個,利用重組單株將金柑屬珠心胚性狀進一步縮小到3.51MB-3.75MB區(qū)域內(nèi),該區(qū)域內(nèi)共35個基因,其中17個基因與共分離標記連鎖。連續(xù)5年對HB柚(Citrus grandis)×Fairchild橘(C.reticulata×Citrus grandis)的雜交F1分離群體已結(jié)果的后代進行表型分析,5年結(jié)果總計單胚后代66株,多胚后代58株,單胚和多胚的分離比例近似1:1。利用BSA-seq法對20個單胚子代和20個多胚子代分別進行DNA混池分析,將控制珠心胚性狀的基因定位于4號染色體2.5Mb至3.9Mb區(qū)間。利用分子標記對該位點在此群體中進行了驗證,并將候選定位區(qū)域縮短到480Kb內(nèi),該區(qū)域內(nèi)77個基因,同時也確認控制金柑屬和柑橘屬多胚性狀基因處于同一個位點,并與前人報道的區(qū)域相符。連續(xù)3年對兩個多胚材料紅橘(C.reticulata)×枳殼(Poncirus trifoliata)雜交F1群體進行表型鑒定,共檢測到39株為多胚,28株為單胚,分離比例趨近2:1或1:1。將前面柑橘屬和金柑屬群體定位到的候選位點在該雜交群體中做了遺傳連鎖驗證,發(fā)現(xiàn)有子代中有59株的表現(xiàn)型與該位點的基因型連鎖,但有8個多胚植株與該區(qū)段不連鎖,并發(fā)現(xiàn)該區(qū)段內(nèi)與性狀連鎖的標記均來源于紅橘親本,而枳殼親本中雜合標記在該區(qū)域并沒有連鎖現(xiàn)象,推測枳殼中可能存在其他控制位點。2、RNA高通量測序挖掘山金柑珠心胚起始發(fā)育相關(guān)基因山金柑有無融合生殖和有性生殖兩種類型,通過對無融合生殖起始發(fā)育時期進行細胞學觀察,確定花前胚囊單核時期和花后雙核胚囊時期為無融合生殖起始關(guān)鍵時期,對這兩個時期的胚珠進行RNA高通量測序。通過denovo轉(zhuǎn)錄組分析,共獲得66,699個unigenes和156040個轉(zhuǎn)錄本,其平均長度分別為1647bp和900bp。利用Nr,Nt和Swiss-Prot三個數(shù)據(jù)庫對unigene進行同源序列比對,分別注釋3,665(35.48%),15,959(23.92%),18,267(27.39%)個unigene。基因差異表達分析發(fā)現(xiàn),珠心胚起始細胞開始出現(xiàn)的階段中,與單胚胚珠相比多胚胚珠有316個基因上調(diào)表達,557個下調(diào)表達;珠心胚起始細胞大量出現(xiàn)的階段中,多胚胚珠有532個基因上調(diào)表達,541個下調(diào)表達。通過分析候選區(qū)域內(nèi)基因的表達差異發(fā)現(xiàn)CitRWP基因(comp57556_c0,Cs4g05960)可能為珠心胚發(fā)育的關(guān)鍵基因。此外,KEGG相關(guān)途徑分析顯示激素信號路徑有差異,差異基因中共檢測到25個差異表達基因與生長素和細胞分裂素轉(zhuǎn)導途徑相關(guān)。從差異基因中隨機挑選20個基因進行q PCR驗證,結(jié)果表明RNA-seq數(shù)據(jù)可靠。3、柑橘無融合生殖候選基因CitRWP的功能分析和相關(guān)分子標記的開發(fā)應用克隆了HB柚、Fairchild橘、克里曼丁橘、山金柑等品種的CitRWP基因,發(fā)現(xiàn)品種間僅有極少SNP差異。實時定量PCR分析表明,CitRWP在晚白柚(C.grandis cv.Wanbai)、枸櫞(C.medica)、克里曼丁橘(C.clementina)等單胚品種的胚珠中低表達,但在Flame葡萄柚(C.paradisi cv.Flame)、檸檬(C.limon)、i*柑(C.reticulata cv.Ponkan)、伏令夏橙(C.sinensis cv.Valencia)等多胚品種中則高表達;選取5個胚珠發(fā)育時期分析CitRWP表達水平,結(jié)果表明CitRWP隨著胚珠發(fā)育表達水平逐漸降低,在多胚山金柑中的表達水平顯著高于單胚。在HB×FC分離群體中,多胚胚珠中該基因的表達量是單胚中上百倍,并且多個時期結(jié)果一致。亞細胞定位表明該基因主要定位于在細胞核中,同時在細胞質(zhì)中也有少量分布。進化分析表明CitRWP不屬于擬南芥已報道的RKD家族,而與小立碗蘚Pp RWP3和Pp RWP4以及地錢Mp RWP1更為相近。多胚品種中CitRWP啟動子區(qū)域存在一個特異插入的MITE轉(zhuǎn)座子。利用該轉(zhuǎn)座子開發(fā)出候選基因相關(guān)聯(lián)的分子標記mite_p1,并在786份柑橘屬種質(zhì)資源中進行驗證,證明該標記與多胚性狀完全連鎖。此外,構(gòu)建了該基因超表達載體,在擬南芥中進行遺傳轉(zhuǎn)化驗證。
【圖文】：

6圖 1-1 無融合生殖與有性生殖相關(guān)概念（Rodriguezleal and Viellecalzada 2012)Sy，助細胞 (橙色)，EC, 卵細胞(藍色), CC 雙核中央細胞(粉色), An, 反足細胞(棕色). NEmb, 心胚，PEmb, 孤雌生殖. Tetrad, 四分體, 2NFG, 雙核未減數(shù)雌配子, AI, 無孢子生殖起始細胞Fig.1-1 Related concepts of apomix and amphimixis (adapted from Rodriguez-Leal)Sy, synergids (orange), EC, the egg cell(blue), CC binucleated central cell(pink), Aantipodals(brown). NEmb, nucellar embryos, PEmb, parthenogenesis (gametophytic pomixis). Tetrtetrad of haploid nuclei, 2NFG, 2-nuclear unreduced female gametophyte, AI, aposporous initial cel無孢子生殖無孢子生殖胚囊通常是從大孢子母細胞周圍的珠心組織分化而來的，其遺傳成與母體一致，也是未減數(shù)的。大孢子母細胞的合點端珠心細胞分裂旺盛，能夠化產(chǎn)生無孢子生殖胚囊，這些珠心細胞稱為無孢子生殖原始細胞(aposporous initcells，AI)，這些細胞通過有絲分裂產(chǎn)生未減數(shù)胚囊(Naumova and Willemse 1995)

第二年的授粉實驗中，由于選用母本 PN1、PN2、PN3 花期較早，4 月就已開花，此時父本尚未進入開花期，故使用上一年-20℃保存的花粉 DB02，通過萌發(fā)試驗發(fā)現(xiàn)保存一年后的 DB02 花粉活率為 76.8%，花粉萌發(fā)活力為 22.3%，仍保持較高活力，可以用于雜交授粉。由于山金柑的自交親和性與不親和性未見報道，我們對雜交授粉和自交的花粉和柱頭做了親和性檢測，發(fā)現(xiàn)雜交和自交的花粉都能在山金柑柱頭上萌發(fā)，且在授粉 24 h 后就能萌發(fā)一定長度（圖 2-2）2012 年 6 月-9 月進行雜交授粉，3 個父本，12 個母本進行雜交組合，授粉約3000 朵花，得到雜交種子約 500 顆，經(jīng)過試管播種、煉苗、移栽存活 271 棵。但由于此次雜交所得到的群體個數(shù)太少，，無法用于后期遺傳分析。我們于 2013 年 4 月-月再次對進行山金柑進行雜交授粉，以單胚山金柑 PN 系、LT 系為母本，父本為多胚山金柑 DB02，創(chuàng)建了 5 個雜交組合（圖 2-3，表 2-2）。將雜交種子去除種皮，30℃ 催芽長出胚根后，播種于加溫溫室的苗床上，23-28℃育苗，大部分種子兩周內(nèi)以上破土萌發(fā)，待植株長到 8-10 片葉后，定植于大育苗盆中共成苗 1387 棵。
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：S666


本文編號：2612494