【摘要】：玫瑰(Rosa rugosa)是薔薇科薔薇屬多年生落葉性灌木,花型秀美,氣味芬芳,形色俱佳,具有極高的觀賞價值。玫瑰雖然品種繁多,但花色較少,粉紅色和紫紅色為主,白色品種較少,缺乏黃色、大紅色、橙色和復色等品種。因此,當前育種科研人員的主要目標是對玫瑰花色進行改良和創(chuàng)新�；ㄇ嘬张c植物花色關系密切�；ㄇ嘬�(Anthocyanins)屬于水溶性的純天然色素,普遍存在于自然界中眾多植物的莖、葉、花、果和種子等器官中,是由類黃酮生物合成途徑中的花青苷生物合成途徑來合成的,在玫瑰的花瓣呈色過程中占據(jù)主導作用。在花青苷生物合成途徑中,雖然有許多基因已被報道與調(diào)控花青苷的形成有關,但關于糖基轉(zhuǎn)移酶基因等下游結(jié)構(gòu)基因的報道卻很少,而花青苷的最終形成則取決于糖基轉(zhuǎn)移酶的糖基化作用。糖基化對于提高花青苷在植物中的穩(wěn)定性和溶解度方面起著非常重要的作用。目前,對于玫瑰花色形成機理的研究較為缺乏,因此研究糖基轉(zhuǎn)移酶基因在花青苷生物合成過程中的功能和相應的分子機制,對于闡明玫瑰花瓣的呈色機理,進而創(chuàng)新和改良玫瑰花色具有重大意義。本研究主要以?紫枝?玫瑰(R.rugosa?Zizhi?)和山刺玫(R.davurica)作為試驗材料,根據(jù)本實驗室已測得的玫瑰轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),利用RT-PCR的方法從?紫枝?玫瑰花瓣的cDNA中分離得到了2個糖基轉(zhuǎn)移酶基因(RrGT1和RrGT2)的CDS全長序列;采用生物信息學分析的方法對目的基因的序列結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)方面進行了鑒定與分析;采用實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)技術,分析了2個糖基轉(zhuǎn)移酶基因在?紫枝?玫瑰和山刺玫不同組織部位、不同開花時期花瓣中的表達情況;采用病毒誘導基因沉默(VIGS)技術于大田條件下在?紫枝?玫瑰和山刺玫植株中分別沉默了2個糖基轉(zhuǎn)移酶基因,驗證其在花色形成中的功能;采用轉(zhuǎn)基因技術將2個糖基轉(zhuǎn)移酶基因分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)化煙草,以驗證其在不同物種中的生物功能;在得到轉(zhuǎn)基因煙草植株后再次利用VIGS技術沉默轉(zhuǎn)基因植株中的玫瑰糖基轉(zhuǎn)移酶基因,在基因表達層面通過正反兩個方向?qū)?個糖基轉(zhuǎn)移酶基因在花青苷生物合成過程中的功能進行更為深入的探究和驗證。主要研究結(jié)論如下。1.以?紫枝?玫瑰花蕾期花瓣的cDNA為模板,首次克隆得到了兩個糖基轉(zhuǎn)移酶基因的CDS全長序列,即RrGT1,GeneBank登錄號為MK034140,開放閱讀框1161bp,編碼386個氨基酸;RrGT2,GeneBank登錄號為MK034141,開放閱讀框1422 bp,編碼473個氨基酸。2.兩個糖基轉(zhuǎn)移酶基因均含有由44個氨基酸殘基構(gòu)成的典型的PSPG結(jié)構(gòu)域,且均屬于GTB超級家族。RrGT1和RrGT2基因所編碼蛋白的分子式分別為C_(1879)H_(2964)N_(494)O_(556)S_(14)和C_(2334)H_(3628)N_(602)O_(711)S_(18);兩個糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白均以α-螺旋(α-helix)、隨機卷曲(Random coil)為主,且均可以現(xiàn)有的糖基轉(zhuǎn)移酶3D結(jié)構(gòu)為模板構(gòu)建3D模型;兩個糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白均屬于不穩(wěn)定的酸性蛋白;二者均存在糖基化位點且含有眾多的磷酸化位點,無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于非分泌型蛋白;兩個糖基轉(zhuǎn)移酶基因與其他物種中大部分同類基因親緣關系都相對較遠,推測其具有較高的物種特異性。3.RrGT1和RrGT2基因在?紫枝?玫瑰和山刺玫的5個開花時期和7個組織部位當中均有表達,且表達量差異明顯。綜合來看,RrGT1和RrGT2基因的表達可能是受發(fā)育調(diào)控的且具有一定的組織特異性,推測其與花青苷的生物合成有關。另外,因為二者在葉片中的高表達水平,推測其還與葉片中其它次生代謝產(chǎn)物的糖基化有關。4.病毒誘導基因沉默(VIGS)降低了?紫枝?玫瑰和山刺玫中內(nèi)源RrGT1和RrGT2基因的轉(zhuǎn)錄本豐度。經(jīng)VIGS處理之后,空病毒載體組和空白對照組的花色基本一致,而基因沉默組的花色明顯變淺。而實時熒光定量PCR的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),空病毒載體組和空白對照組中內(nèi)源RrGT1和RrGT2基因的表達量基本一致,而基因沉默組中內(nèi)源RrGT1和RrGT2基因的表達量則分別顯著降低。花青苷代謝通路中RrGT1和RrGT2基因上游6個關鍵結(jié)構(gòu)基因(RrCHS,RrCHI,RrF3H,RrF3’H,RrDFR和RrANS)在空白對照組、空病毒載體組和基因沉默組的相對表達量基本一致,無明顯變化。由此推測,花色的變淺可能與內(nèi)源RrGT1和RrGT2基因的轉(zhuǎn)錄后沉默有關。5.在?紫枝?玫瑰和山刺玫中均可檢測到6種花青苷:Cy3G5G,Pg3G5G,Cy3G,Pn3G5G,Pg3G和Pn3G。在?紫枝?玫瑰中,Pn3G5G的含量最高,其次是Cy3G5G,而其余四種花青苷的含量都相對較低。經(jīng)VIGS處理后,幾種花青素含量明顯降低。其中,Pn3G5G的含量下降最為顯著,其次是Cy3G5G,其他幾種花青苷的含量都有不同程度的下降,而沒有檢測到Pg3G的存在。而在山刺玫中,Cy3G5G的含量最高,其次是Cy3G,而其余四種花青苷的含量都相對較低。經(jīng)VIGS處理后,幾種花青素含量明顯降低。其中,Cy3G5G的含量下降最為顯著,其次是Cy3G,其他幾種花青苷的含量都有不同程度的下降,而沒有檢測到Pn3G的存在。這也是首次探明了山刺玫的花色主要由Cy3G5G控制。6.RrGT1和RrGT2基因的過表達促進了煙草中花青苷的積累。與轉(zhuǎn)化空表達載體組和空白對照組相比,轉(zhuǎn)RrGT1和RrGT2基因煙草株系的花冠顏色明顯加深。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),在煙草花冠中檢測到的最主要的花青苷為矢車菊素糖苷,這與前人的研究結(jié)果一致。而與空白對照組和空表達載體組相比,轉(zhuǎn)RrGT1和RrGT2基因煙草株系的花冠中,花青苷的含量明顯增加。由此說明,RrGT1和RrGT2基因與煙草中花青苷的生物合成有關。7.病毒誘導RrGT1和RrGT2基因的沉默降低了轉(zhuǎn)基因煙草花冠中花青苷的積累。對RrGT1和RrGT2基因的轉(zhuǎn)基因煙草株系進行外源RrGT1和RrGT2基因的沉默后發(fā)現(xiàn),與空白對照組和空病毒載體組相比,基因沉默組中的花冠顏色明顯變淺,同時基因沉默組中RrGT1和RrGT2基因的表達量分別大幅下降,且基因沉默組中煙草花冠的花青苷含量明顯降低。由此推測,RrGT1和RrGT2基因是直接影響花青苷生物合成的關鍵酶基因。
【圖文】：

絕大部分會與單糖相結(jié)合形成糖苷，稱為花青苷（趙宇瑛和張漢鋒，2005；Ge et al.,2012）。由于花青苷中糖基的數(shù)目、糖的結(jié)構(gòu)以及與糖苷相結(jié)合的有機酸的位置的不同，其種類也變得繁多（Araceli et al.，2009）。當前共有 600 多種花青苷已被分離得到，但它們基本皆由六種苷元為前體合成的，分別為：矢車菊素苷元（Cyanidin）、飛燕草素苷元（Delphinidin）、天竺葵素苷元（Pelargonidin）、芍藥花素苷元（Peonidin）、矮牽牛素苷元（Petunidin）和錦葵素苷元（Malvidin）（戴思蘭和洪艷，2016）。類黃酮類化合物是以苯丙氨酸作為前體，歷經(jīng)三個階段的生物合成得到的。首先，苯丙氨酸被苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化，合成 4-香豆酰 CoA；然后，，4-香豆酰 CoA 和丙二酰 CoA 被查爾酮合成酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）和黃烷酮羥化酶（F3H）催化，合成黃烷酮和二氫黃酮醇；最終，上游產(chǎn)物被二氫黃酮醇還原酶（DFR）和花青素合成酶（ANS）催化，先形成無色的花青素，再形成有色的花青素，然后又被類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）催化形成能夠穩(wěn)定存在的有色花青苷（趙宇瑛和張漢鋒，2005；侯夫云等，2009；賈趙東等，2014）。

玫瑰花青苷合成相關糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆及功能分析2.6.4.1 確定大田條件下 VIGS 發(fā)生的最佳接種時期根據(jù) 紫枝 玫瑰和山刺玫的往年花期和現(xiàn)階段抽枝發(fā)芽的生長情況以及最近一個周的天氣預報，確定的接種日期為2018年3月中旬至4月中旬。具體時間為：接種日期的下午2點半至4點半。2.6.4.2 重組病毒載體的構(gòu)建
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：S685.12

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本文編號：2610459