【摘要】：石斛屬(Dendrobium),隸屬于蘭科(Orchidaceae)樹蘭亞科(Epidendreae),因其花形奇特、花色豐富和花香四溢的特性,成為重要的花卉種質(zhì)資源,已經(jīng)培育了大量的人工雜交品種,但缺乏花朵純明黃色且具有花香的品種,而在自然種中,鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum)的花不僅為純正的明黃色,同時擁有芬芳的香氣。因此,本研究以鼓槌石斛為對象,采用英國皇家園藝學(xué)會比色卡和分光色差儀對鼓槌石斛各個花期的顏色進(jìn)行鑒別;利用合相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(UPC2-MS/MS)進(jìn)行類胡蘿卜素定性、定量分析;利用超高效液相色譜-電噴霧離子化-多級質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-ESI-MSn)進(jìn)行類黃酮和花青素定性、定量分析;運(yùn)用固相微萃取(SPME)結(jié)合GC-MS技術(shù)測定花朵揮發(fā)性組分及其含量變化;對鼓槌石斛花瓣組織的RNA提取方法進(jìn)行了優(yōu)化和改良;運(yùn)用Illumina測序技術(shù)對鼓槌石斛不同發(fā)育時期的整朵花進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,同時利用qRT-PCR技術(shù)分析了石斛的類胡蘿卜素和萜烯類合成途徑中差異基因的表達(dá)模式,從而對其花色和花香形成的分子調(diào)控機(jī)理進(jìn)行研究。主要研究結(jié)果如下:(1)鼓槌石斛花蕾期的花瓣為綠色;透色期的花瓣為黃綠色;最后開放期的花瓣為明黃色。在鼓槌石斛的花瓣開放過程中明度、亮度和彩度先上升后下降,大約在第3-5天時達(dá)到最高。在鼓槌石斛透色期和盛開期的花瓣中均沒有檢測到類黃酮和花青素,認(rèn)為花瓣呈黃色與花青素和類黃酮無關(guān)。在透色期花瓣中檢測到葉黃素含量為125.62 μg/g、花藥黃質(zhì)為18.35 μg/g和玉米黃質(zhì)為59.34 μg/g;盛花期中花瓣的類胡蘿卜素總量迅速增加,其中葉黃素、花藥黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)含量分別增加40.47 μg/g、89.85 μg/g和397.06 μg/g。認(rèn)為葉黃素、花藥黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)是鼓槌石斛花朵呈黃色的主要代謝物質(zhì)。(2)在中午12點到14點之間,對鼓槌石斛花朵透色期、半開期、盛開期和衰敗期的香氣成分進(jìn)行測定,共鑒定出揮發(fā)性組分33種。透色期香氣含量為5.2 nmol·花-1,香氣物質(zhì)有3種,主要是萜烯類;初開期揮發(fā)性物質(zhì)總量為13.48 nmol·花-1 6種香氣物質(zhì)為酯類和萜烯類,分別占總香氣釋放量的44.2%和55.8%;盛開期迅速上升到167.48 nmol ·花-1 檢測到31種香氣物質(zhì),以酯類和萜烯類為主,占總香氣的53.6%和30.2%;在衰敗期下降到10.36 nmol ·花-1,萜烯類占到93.3%。鼓槌石斛盛開期花朵在一天中不同采樣時間的花香物質(zhì)中共鑒定出揮發(fā)性組分31種,8:00時香氣總釋放量為99.08 nmol ·花-1 14種香氣物質(zhì),以酯類、萜烯類和醛類為主,釋放量分別占總香氣成分的53.0%和32.2%。11:00時總釋放量增加到122.86 nmol·花-1 香氣物質(zhì)增加到23種。14:00時達(dá)到最高167.48 nmol ·花-1 31種香氣物質(zhì)的釋放量在此時也達(dá)到最大值,酯類和萜烯類分別占總香氣成分的53.6%和30.2%。17:00時減少為56.3 nmol ·花,醇類和萜烯類組分明顯減少,釋放量也減少為11.8%和5.0%。20:00時僅為25.07 nmol·花-1,僅有6種香氣物質(zhì),占總香氣成分的80.1%。通過對各揮發(fā)性物質(zhì)香氣值(含量/嗅感閾值)的測定,發(fā)現(xiàn)鼓槌石斛呈現(xiàn)香氣的主要物質(zhì)為單萜類,如β-羅勒烯、α-菠烯、β-蒎烯和D-檸檬烯等。(3)以鼓槌石斛透色期、半開期、盛開期和衰敗期的整朵花為樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,共產(chǎn)出18817483680 nt數(shù)據(jù)。利用de novo組裝技術(shù)組裝出60711個Unigene。通過基因功能注釋和差異表達(dá)分析,得到了 13個與類胡蘿卜素合成相關(guān)的基因,分別是PSY、PDS、ZDS、CRTISO、ZISO、LCYB、CHYB、VDE、ZEP、LCYE、CYP450、NCED 和CCD1;與萜類合成相關(guān)的4個基因GPPS、DXR、DXS和TPS。(4)對己獲取的13個類胡蘿卜素合成相關(guān)的基因在鼓槌石斛花朵的幼蕾期、蕾期、透色期、半開期、盛開期和衰敗期進(jìn)行qRT-PCR。結(jié)果表明:PSY在花朵發(fā)育幼蕾期、蕾期、透色期和半開期持續(xù)表達(dá),且表達(dá)量基本穩(wěn)定,這可能顯示與類胡蘿卜素在花朵發(fā)育過程中能夠持續(xù)合成有關(guān);LCYE和CYP450在花朵發(fā)育的幼蕾期到盛開期間持續(xù)表達(dá),且變化不大,這可能與葉黃素在花瓣中能夠持續(xù)合成相關(guān);LCYB在花朵發(fā)育過程中的表達(dá)量總體升高,并在盛開期表達(dá)量達(dá)到最大值,可能是花朵在發(fā)育過程中葉黃素生物合成增加的原因;PDS、ZDS、CRTISO和ZISO在鼓槌石斛花開放過程中表達(dá)量迅速增加,這與著色過程中類胡蘿卜素含量的迅速增加相一致,因此這些基因表達(dá)量的上升是類胡蘿卜素含量快速增加的原因之一;LCYB、CHYB和VDE的表達(dá)量在花朵的盛開期達(dá)到了頂峰,這三個基因都與玉米黃質(zhì)和花藥黃質(zhì)的合成有關(guān),因此這三個基因可能是玉米黃質(zhì)和花藥黃質(zhì)在盛花期含量得到顯著增加的主要因素;NCED能夠使花藥黃質(zhì)分解,且其產(chǎn)物是脫落酸(ABA)合成前體,它的表達(dá)量在整個花期的各個階段表現(xiàn)出持續(xù)增高的現(xiàn)象,且在衰敗期達(dá)到了最高值,因此NCED對于β-胡蘿卜素的降解可能起主導(dǎo)作用且貫穿整個花期,同時它可能也參與花朵的衰老進(jìn)程;CCD1也參與類胡蘿卜素的分解,它的表達(dá)量在半花期時達(dá)到了最高,表明它主要在半花期時參與了類胡蘿卜素的分解。同時,也將這13個基因在鐵皮石斛和鼓槌石斛的盛花期的花瓣中進(jìn)行qRT-PCR,是結(jié)果表明鼓槌石斛花瓣中PSY、PDS、ZDS、LCYE、ZEP、MCED和CYP450的表達(dá)量低于這些基因在鐵皮石斛中的表達(dá)量。而ZISO、LCYS、CHYB、VDE和CCD1在鼓槌石斛花瓣中的表達(dá)量高于在鐵皮石斛中的表達(dá)量。因此,鼓槌石斛花瓣中ZISO、CRTISO、LCYB、CHYB和VDE的大量表達(dá)可能是造成鐵皮和鼓槌石斛花朵顏色產(chǎn)生差異,以及鼓槌石斛花朵含有更多類胡蘿卜素的原因。(5)將參與萜烯類主鏈合成通路中的4個結(jié)構(gòu)基因和參與類胡蘿卜素分解的CCD1基因在鼓槌石斛花朵的透色期、半開期、盛開期和衰敗期,以及鐵皮石斛的盛花期中進(jìn)行qRT-PCR。結(jié)果表明,這5個基因在鼓槌石斛盛花期花瓣中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于在鐵皮石斛中的表達(dá)量。同時,GPPS、DXS、DXR和TPS的表達(dá)量在花瓣的透色期和半開期之間有一個迅速升高的過程,并在半開期時達(dá)到了最高,隨后表達(dá)量開始下降。這與鼓槌石斛花朵萜烯類揮發(fā)性物質(zhì)的含量變化相一致。因此,GPPS、DXS、DXP 和TPS這四個基因可能是鼓槌石斛花朵能夠產(chǎn)生萜烯類揮發(fā)性物質(zhì)的主要原因。參與類胡蘿卜素分解的CCD1在鼓槌石斛中表達(dá)量的變化趨勢與GPPS、DXS、DXR和TPS的表達(dá)量變化趨勢相似,且在鼓槌石斛盛花期花朵中CCD1的表達(dá)量遠(yuǎn)高于在鐵皮石斛中的表達(dá)量。CCD1能夠催化分解類胡蘿卜素,且某些分解產(chǎn)物能夠參與合成一些揮發(fā)性物質(zhì)。因此,CCD1可能參與了鼓槌石斛花香物質(zhì)的合成。本研究探討了鼓槌石斛花朵顏色的形成機(jī)理;明確了鼓槌石斛花朵特征香氣物質(zhì);通過轉(zhuǎn)錄組分析和qRT-PCR技術(shù)篩選出了參與鼓槌石斛類胡蘿卜素和萜烯類生物合成關(guān)鍵酶。在鼓槌石斛的花朵中,通過DXS和DXR等酶催化合成的異戊烯焦磷酸(IPP)是鼓槌石斛花香產(chǎn)物中萜類合成的重要中間產(chǎn)物,也是鼓槌石斛花瓣中類胡蘿卜素的合成前體。同時,鼓槌石斛CCD1在花瓣中的大量表達(dá),參與了部分類胡蘿卜素的裂解,其裂解產(chǎn)物可能是一些揮發(fā)性萜類物質(zhì)的合成前體。因此,通過對IPP代謝途徑和CCDJ的調(diào)控,可以達(dá)到鼓槌石斛花色花香共調(diào)控的目的。這些結(jié)果為未來通過基因工程對石斛品種的改良提供理論依據(jù)。
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２０１０；高慧君等，２０１５）。逡逑目前，有關(guān)植物類胡蘿卜素的主要生物合成和分解途徑，以及參與通路的關(guān)鍵酶及逡逑其編碼基因得到了深入的研究和描述（圖１－１）邋（Ｚｈｕ邋ｅｆ邋ａ／．，邋２０１０；邋Ｏｈｍｉｙａｉ邋ｅｒ邋ａ／．，逡逑２０１２，２０１３；邋Ｃｄｒｄｅｎａｓ－Ｃｏｎｅｊｏｅｆ邋ａ／．，２０１５；邋Ｃｈａｎｄｌｅｒ邋扣邋ａ／．，邋２０１７）。異戊烯焦y酸（ＩＰＰ）逡逑是類胡蘿卜素的合成前體，而ＭＥＰ途徑（質(zhì)體中）和ＭＶＡ途徑（細(xì)胞質(zhì)中）都可以合逡逑成ＩＰＰ，但高等植物中的ＩＰＰ主要通過ＭＥＰ途徑合成（Ｓｕｎ以ａ／．，邋２０１７）。ＩＰＰ經(jīng)過ＩＰＰ逡逑異構(gòu)酶ＯＰＰＩ）和樾牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶（ＧＧＰＰＳ）縮合生成櫳牛兒基櫳牛兒基逡逑焦磷酸（ＧＧＰＰ）邋（Ｅｉｓｅｎｒｅｉｃｈ邋以邋ａ／．，２００４，邋Ｃａｚｚｏｎｅｌｌｉ邋以邋ａ／．，２０１０；邋Ｃｄｒｄｅｎａｓ－Ｃｏｎｅｊｏ邋Ｗ邋ａ／．，逡逑２０１５；邋Ｈｙｕｎ扣ａ／．，２０１２）。ＧＧＰＰ是類胡蘿卜素的合成前體，兩分子ＧＧＰＰ在八氫番茄逡逑紅素合成酶（ＰＳＹ）的作用下縮合形成無色八氫番茄紅素（Ｂｅｙｅｒ邋ａｎｄ邋Ｋｌｅｉｎｉｇ，１９９１）。逡逑然后無色八氫番茄紅素依次經(jīng)過八氫番茄紅素脫氫酶（ＰＤＳ）、胡蘿卜素異構(gòu)酶逡逑（Ｚ－ＩＳＯ）、Ｃ－胡蘿卜素脫氫酶（ＺＤＳ）和胡蘿卜素異構(gòu)酶（ＣＲＴＩＳＯ）的作用最終形成逡逑全反式番琉紅素（Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄ，邋２００６；邋Ｌｉｅｆ邋ａ／．邋，２００７；邋Ｃａｚｚｏｎｅｌｌｉ邋以邋ａ／．，邋２０１０）。隨后通過番逡逑茄紅素環(huán)化酶對全反式番茄紅素進(jìn)行環(huán)化是類胡蘿卜素代謝重要分支點。植物中存在２逡逑種番茄紅素環(huán)化酶ＬＣＹＢ和ＬＣＹＥ

Ｋｎｕｄｓｅｎ等（２００６）發(fā)現(xiàn)７０％的植物的花朵香氣成分中都有芳樟醇、月桂烯及羅勒烯逡逑這３種單萜類化合物。參與單萜類代謝途徑的酶主要包括上游的調(diào)控酶（如ＤＸＳ、逡逑ＤＸＲ）、中游的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（如ＧＰＰＳ）和單萜合成酶（如ＬＩＳ、ＧＥＳ）等（圖１－２）。逡逑ＭＥＰ途徑是單萜合成的重要途徑，１－脫氧－木酮糖－５－磷酸合成酶（ＤＸＳ）和脫氧木酮糖－５－逡逑磷酸還原異構(gòu)酶（ＤＸＲ）是ＭＥＰ途徑中的關(guān)鍵酶，也是類異戊二烯化合物代謝的重要調(diào)逡逑控位點（Ｖｒａｎｏｖａｅ／ｆｌ／．，２０１３）。在寬葉薰衣草和玫瑰天竺葵中分別過表達(dá)的各自的逡逑基因后，，導(dǎo)致這兩種植物的單萜類物質(zhì)的含量得到了提高（鄭漢等，２０１６）。此外，一逡逑些研究表明薄荷、含油玫瑰、歐風(fēng)輪和香樟中基因與相應(yīng)的單萜類揮發(fā)性物質(zhì)的合逡逑成呈正相關(guān)（Ｊａｄａｕｎｅｆａ／．，邋２０１７；邋Ｒａｍａｋｅｒａ／．，２０１５；邋Ｌｉｕｅ（ａ／．，邋２０１２邋）。香葉基焦磷酸合逡逑酶（ＧＰＰＳ）是植物中單蔽類物質(zhì)生物合成中一種重要的酶。１分子ＩＰＰ和ＤＭＡＰＰ能夠逡逑通過ＧＰＰＳ的催化縮合形成香葉基焦a愃幔ǎ牽校校�，为单菰u嗷銜锏暮銑商峁┨脊羌�。辶x希牽校校擁幕钚雜跋燉嘁煳於┩揪噸釁淥锏暮銑桑ǎ櫻幔睿紓椋簦幔澹駑澹幔�，邋２０１３）。薄荷憾d謐五義先恢斜衛(wèi)嗷臃⑽锏暮勘浠耄牽校校踴蟣澩鎪接泄兀ㄓ隉斕

本文編號：2606851