發(fā)布時(shí)間：2020-03-29 23:43

【摘要】：植物生長發(fā)育常常受到干旱、高溫、低溫和鹽堿等非生物脅迫的影響,是農(nóng)作物產(chǎn)量與品質(zhì)的主要制約因素之一。研究植物對(duì)逆境的應(yīng)答機(jī)制,提高植物對(duì)環(huán)境脅迫的抗性,已成為植物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。近年來,對(duì)于植物抗逆性分子機(jī)制的研究中,在低溫、干旱、鹽脅迫等方面研究較多,而高溫脅迫相關(guān)方面的研究相對(duì)較少,主要集中在高溫相關(guān)的功能蛋白基因和調(diào)控蛋白基因。因此,解析番茄的抗高溫分子機(jī)制,系統(tǒng)深入地研究抗高溫相關(guān)基因在高溫脅迫條件下的表達(dá)與調(diào)控,可以為番茄抗高溫新品種的培育奠定一定的分子基礎(chǔ),為通過基因工程手段提高番茄的抗高溫性開辟新途徑,同時(shí)也為其它農(nóng)作物的抗旱分子育種和品種改良提供基因資源。通過前期的基因芯片篩選及生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)番茄bZIP轉(zhuǎn)錄因子SlbZIP6參與非生物脅迫反應(yīng)。本研究在AC~(++)番茄中克隆得到SlbZIP6,以其為研究對(duì)象,研究SlbZIP6基因在番茄高溫脅迫過程中的功能。主要研究結(jié)果如下:1.以番茄葉片cDNA作為模板,通過PCR得到約1365bp大小的目的片段,成功克隆得到SlbZIP6。生物信息學(xué)表明SlbZIP6轉(zhuǎn)錄因子編碼454個(gè)氨基酸,預(yù)測分子式為C_(2057)H_(3335)N_(625)O_(705)S_(16),分子量為48.61kD。SlbZIP6蛋白不具信號(hào)肽序列,不具有跨膜結(jié)構(gòu)域,定位于細(xì)胞核中。聚類分析結(jié)果表明SlbZIP6蛋白與辣椒CaCPRF2、煙草NtCPRF2、大豆GmHBF-1具有較高的同源性。2.通過對(duì)AC~(++)施用外源激素和各種非生物脅迫處理,利用qRT-PCR分析SlbZIP6基因在外源激素和各種非生物脅迫處理下不同組織和部位的表達(dá)情況。結(jié)果表明:在高溫、干旱和鹽處理等逆境處理下,SlbZIP6基因在AC~(++)中有表現(xiàn)為明顯的上調(diào)表達(dá)的趨勢。在ABA處理下,SlbZIP6基因在AC~(++)中迅速響應(yīng)表達(dá);在SA處理下,SlbZIP6基因的表達(dá)在后期有明顯的上調(diào)表達(dá)趨勢;在SlbZIP6基因表達(dá)基本不受GA、JA和乙烯處理的影響。3.成功構(gòu)建含有SlbZIP6的超量表達(dá)載體和RNAi沉默表達(dá)載體,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,成功將超表達(dá)載體中的SlbZIP6超表達(dá)基因?qū)敕鸦蚪M中,獲得了超表達(dá)的轉(zhuǎn)SlbZIP6基因番茄植株;同時(shí)將RNAi沉默表達(dá)載體中SlbZIP6干擾基因轉(zhuǎn)入番茄,獲得抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因番茄植株。4.將轉(zhuǎn)SlbZIP6基因番茄植株和野生型AC~(++)番茄同時(shí)高溫處理,結(jié)果表明超表達(dá)SlbZIP6降低了番茄對(duì)高溫的耐受力。高溫脅迫后的生理生化研究結(jié)果表明,超表達(dá)植株在高溫處理后積累了較少的脯氨酸與野生型AC~(++)番茄相比,而丙二醛含量的積累比AC~(++)番茄顯著增加,另外,超表達(dá)植株的相對(duì)電導(dǎo)率也有顯著的提高。5.通過分析SlbZIP6超量表達(dá)和野生型AC~(++)番茄中的高溫相關(guān)基因可知,相對(duì)野生型對(duì)照而言,發(fā)現(xiàn)在超表達(dá)植株中HsfA2、HsfB1、Hsp90、Hsp100的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào),SOD和APX的表達(dá)量增加,AREB1、PP2C2、NCED和TAS14基因的表達(dá)量下降,表明SlbZIP6可能通過調(diào)控這些基因的表達(dá)來調(diào)控植物的耐熱分子機(jī)制。
【圖文】：

4 結(jié)果與分析4 結(jié)果與分析 SlbZIP6 基因的擴(kuò)增茄葉片 cDNA 作為模板，使用引物 P800/P801，利R Max DNA 聚合酶通過 PCR 擴(kuò)增得到 PCR 產(chǎn)物，由凝5bp 大小的片段，如圖 4.1 所示。將克隆得到的目的unt 克隆載體連接，用通用引物 M13F/M13R，，挑取單菌落。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示下圖 4.2，擴(kuò)增得。將陽性單克隆送至華大基因測序，測序結(jié)果與目的片段功的克隆了基因 SlbZIP6 并連接到 pEASY-Blunt 克隆載體

將陽性單克隆送至華大基因測序，測序結(jié)果與目的片段序列一致（圖4.3），成功的克隆了基因 SlbZIP6 并連接到 pEASY-Blunt 克隆載體。圖 4.1 SlbZIP6 基因擴(kuò)增結(jié)果M: BM2000+ DNA Marker；泳道 1 和 2：PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 4.1 Amplification of SlbZIP6 geneM: BM2000+ DNA Marker；Lanes1-2：PCR products
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：S641.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Jeevanandam Vanitha;Srinivasan Ramachandran;;Genome-wide Expansion and Expression Divergence of the Basic Leucine Zipper Transcription Factors in Higher Plants with an Emphasis on Sorghum[J];Journal of Integrative Plant Biology;2011年03期

2 杜秀敏,殷文璇,趙彥修,張慧;植物中活性氧的產(chǎn)生及清除機(jī)制[J];生物工程學(xué)報(bào);2001年02期

本文編號(hào)：2606682