本研究構(gòu)建了鰻弧菌和遲緩愛德華氏菌刺激后半滑舌鰨主要免疫器官(頭腎、脾)的cDNA文庫(kù)，通過隨機(jī)測(cè)序，從文庫(kù)中篩選獲得兩個(gè)免疫相關(guān)因子ISG15(Interferon Stimulated Gene15)和Mig1(Megalocytivirus induced gene1)。 在哺乳動(dòng)物中，ISG15已被報(bào)道參與宿主的抗病毒免疫，并且這一過程可能與ISG15具有的一種類似泛素化修飾的功能相關(guān)。本研究中，新分離的半滑舌鰨ISG15，簡(jiǎn)稱CsISG15，也被證實(shí)參與宿主的抗病毒免疫。熒光定量RT-PCR和Western Blot雜交的結(jié)果均表明，RBIV-C1病毒感染后，舌鰨頭腎和脾中ISG15的表達(dá)量急劇上升；與此相對(duì)的，當(dāng)用RNA干擾手段降低頭腎淋巴細(xì)胞中ISG15表達(dá)后，胞內(nèi)病毒入侵?jǐn)?shù)顯著增多。為進(jìn)一步研究ISG15作用的機(jī)制，通過原核重組表達(dá)，分別獲得了野生型和突變型的重組蛋白，二者均于活性條件下成功得以純化，其中突變型蛋白的LRGG保守區(qū)被突變?yōu)長(zhǎng)AAG。研究發(fā)現(xiàn)，野生型重組蛋白可激活巨噬細(xì)胞，并可大大降低病毒感染后頭腎淋巴細(xì)胞中的病毒數(shù)量；相反的，當(dāng)用抗體中和掉頭腎淋巴細(xì)...

【文章頁(yè)數(shù)】：91 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 魚類先天免疫系統(tǒng)
    1.2 魚類先天免疫與抗病毒
        1.2.1 宿主對(duì)病毒的識(shí)別與信號(hào)通路的激活
        1.2.2 干擾素
            1.2.2.1 干擾素的分類與命名
            1.2.2.2 干擾素誘導(dǎo)的基因(ISGs)
            1.2.2.3 ISG156
    1.3 腫大細(xì)胞病毒
    1.4 半滑舌鰨簡(jiǎn)介
    1.5 本研究的目的和意義
第二章 半滑舌鰨 cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建及抗病毒因子的篩選
    2.1 材料和方法
        2.1.1 半滑舌鰨cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
            2.1.1.1 病原刺激及半滑舌鰨脾、腎組織的收集
            2.1.1.2 半滑舌鰨RNA的提取
            2.1.1.3 半滑舌鰨cDNA的合成
            2.1.1.4 文庫(kù)構(gòu)建
        2.1.2 半滑舌鰨抗病毒基因的篩選
    2.2 結(jié)果與討論
        2.2.1 CsISG15 序列分析
        2.2.2 CsMig1 序列分析
第三章 CsISG15、CsMig1 與半滑舌鰨抗病毒免疫的相關(guān)性研究
    3.1 材料和方法
        3.1.1 正常生理?xiàng)l件下CsISG15、CsMig1 在各組織中的表達(dá)分布
        3.1.2 病毒感染后CsISG15、CsMig1 在主要免疫器官中的表達(dá)變化
        3.1.3 病毒感染后CsISG15 在頭腎淋巴細(xì)胞中的表達(dá)變化
        3.1.4 提高或降低CsISG15、CsMig1 的表達(dá)對(duì)淋巴細(xì)胞抗病毒能力的影響29
            3.1.4.1 RNA干擾質(zhì)粒pRiCsISG15 和過量表達(dá)載體pCsMig1 的構(gòu)建...29
            3.1.4.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染淋巴細(xì)胞
            3.1.4.3 RNA干擾和過量表達(dá)效果檢測(cè)
            3.1.4.4 RNA干擾和過量表達(dá)對(duì)淋巴細(xì)胞抗病毒感染的影響
    3,2 結(jié)果和討論
        3.2.1 CsISG15、CsMig1 的組織特異性表達(dá)
        3.2.2 病毒感染后CsISG15、CsMig1 在主要免疫器官及免疫細(xì)胞中的表達(dá)變化
        3.2.3 RNA干擾降低CsISG15 表達(dá)對(duì)淋巴細(xì)胞抗病毒感染的影響
        3.2.4 過量表達(dá)CsMig1 對(duì)淋巴細(xì)胞抗病毒感染的影響
        3.2.5 討論與小結(jié)
第四章 CsISG15 重組蛋白的抗病毒功能研究
    4.1 材料和方法
        4.1.1 野生型重組蛋白rCsISG15 原核表達(dá)株的構(gòu)建
        4.1.2 突變型重組蛋白rCsISG15M原核表達(dá)株的構(gòu)建
        4.1.3 重組蛋白rCsISG15、rCsISG15M的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
        4.1.4 大鼠抗rCsISG15 多克隆抗體的制備
        4.1.5 CsISG15 重組蛋白的功能研究
            4.1.5.1 CsISG15 重組蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響
            4.1.5.2 CsISG15 重組蛋白對(duì)淋巴細(xì)胞抗病毒感染的影響
            4.1.5.3 抗體中和CsISG15 對(duì)淋巴細(xì)胞抗病毒感染的影響
            4.1.5.4 CsISG15 重組蛋白對(duì)淋巴細(xì)胞中各種免疫因子表達(dá)的影響
        4.1.6 病毒感染后CsISG15 在脾、腎中表達(dá)變化的Western Blot驗(yàn)證
    4.2 結(jié)果和討論
        4.2.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化
        4.2.2 抗體效價(jià)和特異性檢測(cè)
        4.2.3 重組蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞的激活效應(yīng)
        4.2.4 重組蛋白對(duì)淋巴細(xì)胞抗病毒感染的影響
        4.2.5 抗體中和CsISG15 對(duì)淋巴細(xì)胞抗病毒感染的影響
        4.2.6 重組蛋白對(duì)淋巴細(xì)胞免疫相關(guān)因子表達(dá)的調(diào)節(jié)
        4.2.7 病毒刺激頭腎、脾中 CsISG15 表達(dá)的 Western Blot 驗(yàn)證
        4.2.8 小結(jié)與討論
第五章 CsMig1 上游調(diào)控因子的初步研究
    5.1 材料和方法
    5.2 結(jié)果和討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄 常見溶液的配置
個(gè)人簡(jiǎn)歷
博士期間發(fā)表的文章



本文編號(hào)：4034592