行有性生殖的生物都有兩種不同的性別,發(fā)育過程中都涉及到性別決定。因此,性別決定與分化及其分子機(jī)制是最基礎(chǔ)的生物學(xué)問題之一。哺乳類性別決定與分化是由一系列轉(zhuǎn)錄因子和信號傳導(dǎo)因子連接成網(wǎng)構(gòu)成的協(xié)同作用通路,而硬骨魚類還不清楚。許多經(jīng)濟(jì)動物(養(yǎng)殖魚類)生長速率有明顯的性別差異,如尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)雄魚比雌魚生長快50%,單性魚養(yǎng)殖具有較高的經(jīng)濟(jì)價值,因此養(yǎng)殖魚類性別決定與分化的分子機(jī)制及性別控制成為水產(chǎn)動物學(xué)研究的熱點,可以兼顧基礎(chǔ)和應(yīng)用研究。隨著大片段基因組文庫的構(gòu)建和高通量DNA測序技術(shù)的發(fā)展,羅非魚基因組序列已經(jīng)公布,但缺乏Y染色體信息,有必要構(gòu)建含Y染色體信息的大片段基因組文庫。長期以來,養(yǎng)殖魚類缺乏有效的基因敲除手段嚴(yán)重阻礙了其性別決定和分化分子機(jī)制的研究。近幾年,人工核酸內(nèi)切酶介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)TALEN和CRISPR/Cas9的出現(xiàn)使我們能對任意物種的基因組進(jìn)行定點編輯。因此,本研究將探索在羅非魚建立這兩種基因敲除技術(shù),并用于對dmrt1、foxl2、igf3和nanos等基因敲除,研究它們在性別決定與分化中的作用及分子機(jī)制。主要研究結(jié)果如...

【文章頁數(shù)】：134 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中英文縮略語對照表
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 大片段基因組文庫的研究進(jìn)展
        1.1 噬菌體文庫
        1.2 Cosmid文庫
        1.3 Fosmid文庫
        1.4 BAC文庫
        1.5 YAC文庫
        1.6 大片段基因組文庫的應(yīng)用
    2 反向遺傳學(xué)技術(shù)研究概述
        2.1 同源重組
        2.2 RNAi
        2.3 Morpholinos
        2.4 TILLING
        2.5 ZFN
        2.6 TALEN
        2.7 CRISPR/Cas9
        2.8 反向遺傳學(xué)技術(shù)在性別決定與分化研究中的應(yīng)用
    3 脊椎動物性別決定與分化研究進(jìn)展
    4 科學(xué)問題的提出和本研究目的意義
第二章 羅非魚微陣列Fosmid基因組文庫的構(gòu)建及基因篩選
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
        2.2 主要試劑
        2.3 方法
            2.3.1 尼羅羅非魚XY個體基因組DNA的提取
            2.3.2 基因組DNA片段的末端修復(fù)
            2.3.3 連接、包裝和滴度計算
            2.3.4 插入片段大小檢測
            2.3.5 文庫的穩(wěn)定性檢測
            2.3.6 克隆的挑取、池的構(gòu)建及備份保存
            2.3.7 基因篩選方法
    3 結(jié)果
        3.1 抽提的DNA片段大小
        3.2 DNA片段回收與載體的連接
        3.3 文庫滴度
        3.4 插入片段大小
        3.5 文庫穩(wěn)定性
        3.6 文庫克隆的保存和池的構(gòu)建及備份
        3.7 文庫的應(yīng)用—目的基因篩選結(jié)果
    4 討論
        4.1 Fosmid文庫質(zhì)量鑒定、保存及基因篩選策略
        4.2 Fosmid文庫在性別決定和分化研究中的應(yīng)用
第三章 利用TALEN基因敲除技術(shù)研究Foxl2和Dmrt1功能
    1 引言
    2 材料和方法
        2.1 實驗動物
        2.2 主要試劑和TALEN載體
        2.3 方法
            2.3.1 TALEN打靶序列的選擇和載體構(gòu)建策略
            2.3.2 mRNA合成與顯微注射
            2.3.3 基因組DNA的提取、目的片段的擴(kuò)增及酶切檢測
            2.3.4 陽性魚篩選
            2.3.5 組織學(xué)檢測
            2.3.6 免疫組化檢測
            2.3.7 Real-time PCR檢測
            2.3.8 RT-PCR檢測
            2.3.9 血清雌雄激素水平測定
    3 結(jié)果
        3.1 TALEN成功敲除dmrt1和foxl2基因
        3.2 Dmrt1缺失對XY個體羅非魚性腺分化的影響
        3.3 Foxl2缺失對XX個體羅非魚性腺分化的影響
        3.4 Dmrt1和Foxl2缺失對雌激素和雄激素合成的影響
    4 討論
        4.1 養(yǎng)殖魚類羅非魚TALEN靶向基因敲除技術(shù)的建立
        4.2 Dmrt1缺失對精巢分化的影響
        4.3 Foxl2缺失對卵巢發(fā)育的影響
        4.4 Dmrt1和Foxl2拮抗性調(diào)控雌激素水平影響性別分化
第四章 利用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)研究Nanos2和Nanos3的功能
    1 引言
    2 材料和方法
        2.1 實驗動物
        2.2 主要試劑和載體
        2.3 方法
            2.3.1 靶序列的選擇和gRNA合成
            2.3.2 Cas9 mRNA合成與顯微注射
            2.3.3 基因組DNA的提取、目的片段擴(kuò)增及突變檢測
            2.3.4 GFP-vasa 3'UTR載體構(gòu)建和生殖細(xì)胞GFP標(biāo)記
            2.3.5 敲除陽性魚的篩選
            2.3.6 組織學(xué)檢測
            2.3.7 免疫組化檢測
            2.3.8 激素測定
            2.3.9 dmrt1和foxl2突變F1代的建立
    3 結(jié)果
        3.1 CRISPR/Cas9成功敲除羅非魚基因
        3.2 敲除效率統(tǒng)計
        3.3 Nanos缺失對生殖細(xì)胞和性別分化的影響
        3.4 生殖細(xì)胞缺失對雌激素和雄激素合成的影響
        3.5 dmrt1和foxl2突變F1代魚檢測
    4 討論
        4.1 CRISPR/Cas9高效敲除羅非魚性別決定與分化關(guān)鍵基因
        4.2 CRISPR/Cas9介導(dǎo)突變的可遺傳性
        4.3 生殖細(xì)胞缺失對性別分化的影響
        4.4 CRISPR/Cas9在性別決定與分化研究的應(yīng)用前景
    附件
第五章 利用CRISPR/Cas9研究Igf3在性別分化中的功能
    1 引言
    2 材料和方法
        2.1 實驗動物
        2.2 試劑和藥品
        2.3 igf3在性別分化早期表達(dá)模式檢測
        2.4 免疫組化檢測Igf3表達(dá)的細(xì)胞類型
        2.5 Igf3功能的離體研究
        2.6 CRISPR/Cas9敲除igf3對性別分化的影響
        2.7 熒光素酶報告基因和表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.8 HEK283細(xì)胞培養(yǎng)、瞬時轉(zhuǎn)染以及熒光素酶檢測
        2.9 Dmrt1和Foxl2缺失對igf3表達(dá)水平的影響
    3 結(jié)果
        3.1 igf3在羅非魚性腺發(fā)育早期的表達(dá)模式
        3.2 Igf3表達(dá)于羅非魚性腺體細(xì)胞
        3.3 Igf3調(diào)控性別分化相關(guān)類固醇酶和轉(zhuǎn)錄因子
        3.4 CRISPR/Cas9介導(dǎo)的夠敲除
        3.5 igf3敲除對性別分化和相關(guān)基因表達(dá)的影響
        3.6 igf3表達(dá)受性別分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和雌激素的調(diào)控
    4 討論
        4.1 igf3、轉(zhuǎn)錄因子和類固醇酶之間的關(guān)系
        4.2 Igf3與硬骨魚類生殖細(xì)胞減數(shù)分裂
結(jié)論
本研究的主要創(chuàng)新點
參考文獻(xiàn)
致謝
在讀期間發(fā)表的主要論文
在讀期間參加科研情況



本文編號：4020888