抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分,對細(xì)菌,真菌和病毒等病原體具有廣泛的抑制作用。貝類是一種濾食性的水生生物,時刻面臨著水體中大量微生物的侵襲,因此,貝類已進(jìn)化出一套有效的先天免疫系統(tǒng),特別是依靠其抗菌肽進(jìn)行免疫防御。馬氏珠母貝是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價值的珍珠貝,但是目前在馬氏珠母貝中尚未發(fā)現(xiàn)有代表性的抗菌肽分子,這意味著馬氏珠母貝可能依靠其他的免疫效應(yīng)分子來進(jìn)行免疫防御。為了進(jìn)一步探究馬氏珠母貝抵抗環(huán)境病原體的分子機(jī)理,本研究基于馬氏珠母貝基因組數(shù)據(jù)庫,從基因?qū)用娉霭l(fā),篩選馬氏珠母貝免疫效應(yīng)分子并進(jìn)行克隆,分析免疫效應(yīng)分子在病原體相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMPs)刺激后的組織表達(dá)情況,構(gòu)建原核表達(dá)載體,對重組蛋白開展抗菌機(jī)制研究。結(jié)果如下:(1)免疫效應(yīng)分子的篩選與克隆:利用在線Antimicrobial peptide database(APD)的抗菌肽氨基酸序列構(gòu)建本地數(shù)據(jù)庫,與馬氏珠母貝基因組比對,成功篩選出4種免疫效應(yīng)分子并克隆獲得c DNA全長,分別...

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 海洋無脊椎動物抗菌肽研究進(jìn)展
    1.2 胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶研究進(jìn)展
    1.3 Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制因子研究進(jìn)展
    1.4 g型溶菌酶研究進(jìn)展
    1.5 鞘脂蛋白研究進(jìn)展
    1.6 研究目的和意義
2 馬氏珠母貝TLS蛋白酶基因與KuPI蛋白酶抑制劑的基因克隆與功能研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)樣本
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)主要溶液與試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 馬氏珠母貝免疫效應(yīng)分子篩選
        2.2.2 PmTLS與 PmKuPI基因相關(guān)引物設(shè)計
        2.2.3 總RNA提取
        2.2.4 cDNA第一鏈的合成
        2.2.5 中間片段克隆
        2.2.6 3'和5'端RACE擴(kuò)增
        2.2.7 生物信息學(xué)分析
        2.2.8 組織表達(dá)及PAMPs刺激后時序表達(dá)分析
        2.2.9 重組蛋白制備
        2.2.10 純化蛋白抗菌活性檢測
        2.2.11 透射電鏡觀察純化蛋白作用細(xì)菌后的形態(tài)變化
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 PmTLS與 PmKuPI的基因克隆
        2.3.2 PmTLS與 PmKuPI理化性質(zhì)分析
        2.3.3 PmTLS與 PmKuPI同源性分析
        2.3.4 PmTLS與 PmKuPI基因mRNA的組織定量分析
        2.3.5 PAMPs刺激后PmTLS基因mRNA在血細(xì)胞的時序表達(dá)分析
        2.3.6 PmTLS與 PmKuPI重組蛋白的表達(dá)
        2.3.7 rPmTLS與 rPmKuPI的抗菌活性測定
        2.3.8 rPmTLS與 rPmKuPI抗菌作用機(jī)制
    2.4 討論
        2.4.1 PmTLS蛋白酶與PmKuPI蛋白酶抑制劑基因的分子特征
        2.4.2 PmTLS蛋白酶與PmKuPI蛋白酶抑制劑基因mRNA差異分析
        2.4.3 PmTLS蛋白酶與PmKuPI蛋白酶抑制劑的原核表達(dá)
        2.4.4 rPmTLS的功能驗(yàn)證
        2.4.5 rPmKuPI的功能驗(yàn)證
3 馬氏珠母貝g型溶菌酶與鞘脂蛋白Saposin-B的基因克隆與功能研究
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)樣本
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器
        3.1.4 實(shí)驗(yàn)主要溶液與試劑
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 馬氏珠母貝免疫效應(yīng)分子篩選
        3.2.2 PmlysG與 PmSapB基因相關(guān)引物設(shè)計
        3.2.3 基因克隆及生物信息學(xué)分析
        3.2.4 組織差異性及PAMPs刺激后時序表達(dá)分析
        3.2.5 重組蛋白制備
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 PmlysG與 PmSapB的基因克隆
        3.3.2 PmlysG與 PmSapB理化性質(zhì)分析
        3.3.3 PmlysG與 PmSapB同源性分析
        3.3.4 PmlysG與 PmSapB基因mRNA的組織表達(dá)分析
        3.3.5 PAMPs刺激后PmlysG與 PmSapB基因mRNA在肝胰腺的時序表達(dá)分析
        3.3.6 PmlysG與 PmSapB重組蛋白的表達(dá)
    3.4 討論
        3.4.1 馬氏珠母貝g型溶菌酶與鞘脂蛋白Saposin-B基因的分子特征
        3.4.2 馬氏珠母貝g型溶菌酶與鞘脂蛋白Saposin-B基因mRNA差異分析
        3.4.3 馬氏珠母貝g型溶菌酶與鞘脂蛋白Saposin-B的原核表達(dá)
4 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
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導(dǎo)師簡介



本文編號：3988950