發(fā)布時間：2024-04-12 23:44

　　鰻弧菌(Vibrio anguillarum)是一種可引起魚類高致死性出血性敗血癥的病原菌,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大危害和經(jīng)濟損失,迫切需要建立一種準(zhǔn)確、便捷的鰻弧菌檢測方法用于疾病的防控。目前文獻已報道的鰻弧菌檢測方法存在檢測時間長、操作過程復(fù)雜等問題,無法應(yīng)用于養(yǎng)殖漁場等基層單位。本課題基于抗體標(biāo)記技術(shù)開發(fā)以膠體金、量子點及上轉(zhuǎn)磷光材料作為標(biāo)記物的快速免疫層析法檢測鰻弧菌,為鰻弧菌病害的防控提供便捷的檢測方法。 本課題以實驗室分離的一株鰻弧菌毒株MVM425滅活菌體為抗原,制備鰻弧菌單克隆抗體5G4-G4和5G4-B8。以膠體金作為標(biāo)記材料對鰻弧菌單克隆抗體進行標(biāo)記,制備出鰻弧菌膠體金快速檢測試紙條。該試紙條具有良好的特異性,與弧菌屬常見的病原菌無交叉反應(yīng),其檢測限達到105CFU/ml。 據(jù)文獻報道以量子點和上轉(zhuǎn)磷光材料作為抗體標(biāo)記物,可以大幅度提高檢測靈敏度,實現(xiàn)對病原微生物的微量和定量檢測。本課題考察了核-殼型量子點材料CdSe/ZnS和上轉(zhuǎn)磷光材料NaYF4:Yb, Er作為抗體標(biāo)記物在鰻弧菌檢測中應(yīng)用的可行性。通過優(yōu)化抗體與這兩種材料的最佳結(jié)合量,獲得量子點和上轉(zhuǎn)磷光材料標(biāo)記...

【文章頁數(shù)】：61 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻綜述
    1.1 鰻弧菌
    1.2 鰻弧菌的檢測方法
        1.2.1 基于細菌培養(yǎng)及生理生化指標(biāo)檢測的方法
        1.2.2 基于免疫及分子生物學(xué)技術(shù)的檢測方法
    1.3 基于免疫層析技術(shù)的快速檢測試紙條
        1.3.1 快速檢測試紙條
        1.3.2 快速檢測紙條的原理和結(jié)構(gòu)
        1.3.3 快速檢測試紙條在病原菌檢測方面的應(yīng)用
    1.4 抗體標(biāo)記物
        1.4.1 納米金顆粒
        1.4.2 量子點
        1.4.3 上轉(zhuǎn)磷光材料
    1.5 本課題的主要內(nèi)容和意義
第2章 鰻弧菌單克隆抗體的制備
    2.1 前言
    2.2 材料
        2.2.1 細胞、細菌及實驗動物
        2.2.2 主要實驗試劑與緩沖液
    2.3 實驗方法
        2.3.1 制備滅活菌液
        2.3.2 Sp2/0細胞的復(fù)蘇
        2.3.3 采集陰性血清
        2.3.4 免疫小鼠
        2.3.5 測定血清中抗體效價的方法
        2.3.6 準(zhǔn)備飼養(yǎng)細胞
        2.3.7 細胞融合
        2.3.8 融合細胞的培養(yǎng)
        2.3.9 篩選陽性雜交瘤細胞株
        2.3.10 雜交瘤細胞株的去交叉反應(yīng)
        2.3.11 雜交瘤細胞株的克隆
        2.3.12 雜交瘤細胞株的凍存
        2.3.13 單克隆抗體的純化
        2.3.14 抗體的亞型鑒定
        2.3.15 單克隆抗體的效價檢測
        2.3.16 單克隆抗體的濃度測定
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 小鼠的免疫
        2.4.2 細胞融合及去交叉反應(yīng)結(jié)果
        2.4.3 雜交瘤細胞的克隆及去交叉反應(yīng)結(jié)果
        2.4.4 單克隆抗體的亞型測定
        2.4.5 單克隆抗體的效價測定
        2.4.6 單克隆抗體的濃度測定
    2.5 討論
    2.6 結(jié)論
第3章 鰻弧菌膠體金快速檢測試紙條的制備
    3.1 前言
    3.2 材料
        3.2.1 細菌及實驗動物
        3.2.2 主要實驗試劑與材料
    3.3 實驗方法
        3.3.1 多克隆抗體的制備
        3.3.2 多克隆抗體蛋白濃度的測定
        3.3.3 制備膠體金溶液
        3.3.4 膠體金溶液與抗體的結(jié)合
        3.3.5 膠體金快速檢測試紙條的制備
        3.3.6 膠體金快速檢測試紙條性能檢測
        3.3.7 與多重PCR檢測方法的比較
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 多克隆抗體效價
        3.4.2 膠體金溶液的制備
        3.4.3 膠體金溶液與抗體的結(jié)合
        3.4.4 抗體配對結(jié)果
        3.4.5 膠體金快速檢測試紙條的性能測定
        3.4.6 膠體金快速檢測試紙條與多重PCR檢測方法的比較
    3.5 討論
    3.6 結(jié)論
第4章 量子點和上轉(zhuǎn)磷光材料的應(yīng)用探索
    4.1 前言
    4.2 材料
        4.2.1 菌株
        4.2.2 主要實驗試劑與材料
    4.3 實驗方法
        4.3.1 量子點與抗體的結(jié)合
        4.3.2 量子點與抗體結(jié)合的驗證
        4.3.3 量子點與抗體的最佳結(jié)合量
        4.3.4 斑點免疫實驗驗證量子點標(biāo)記抗體的檢測性能
        4.3.5 量子點快速檢測試紙條的研制
        4.3.6 上轉(zhuǎn)磷光材料與抗體的結(jié)合
        4.3.7 上轉(zhuǎn)磷光材料與抗體結(jié)合的驗證及最佳結(jié)合量確定
        4.3.8 上轉(zhuǎn)磷光與抗體快速檢測試紙條的研制
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 量子點標(biāo)記抗體的驗證結(jié)果
        4.4.2 量子點與抗體的最佳結(jié)合量
        4.4.3 斑點雜交實驗考察量子點標(biāo)記抗體的檢測性能
        4.4.4 量子點快速檢測試紙條的研制
        4.4.5 上轉(zhuǎn)磷光材料與抗體結(jié)合的驗證及最佳結(jié)合量確定
        4.4.6 上轉(zhuǎn)磷光材料快速檢測試紙條的研制
    4.5 討論
    4.6 結(jié)論
第5章 結(jié)論、創(chuàng)新點與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 創(chuàng)新點
    5.3 展望
參考文獻
致謝



本文編號：3952154