動(dòng)物生長受到生長軸的調(diào)控,生長激素受體(GHR)和胰島素樣生長因子1(IGF1)是生長軸中的重要組成成分,其基因表達(dá)水平與生長密切相關(guān),是研究生長和生產(chǎn)性狀的候選基因,羅非魚(Oreochromis spp)是重要的世界性養(yǎng)殖魚類。本試驗(yàn)開展為期200天的羅非魚生長對(duì)比試驗(yàn),并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, Q-PCR)技術(shù)對(duì)尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)和奧利亞羅非魚(Oreochromis aureus)生長過程中肝臟和肌肉gh訂和妒的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè),為進(jìn)一步闡述羅非魚生長軸基因表達(dá)機(jī)制、利用分子手段對(duì)羅非魚進(jìn)行選育等工作提供理論依據(jù)。以β-actin為內(nèi)參基因,建立了以SYBR Green染料為熒光指示劑的羅非魚ghr1和igf1的Q-PCR實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了含有g(shù)hr1,igf1和fl-actin特異性片段的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品,5倍梯度稀釋后以3次平行重復(fù)進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增,根據(jù)所得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值計(jì)算三個(gè)基因的拷貝數(shù),以β-actin為看家基因校對(duì),最終確定ghr1和igf1的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果...

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1. 生長激素(GH)
        1.1 GH基因和蛋白結(jié)構(gòu)
        1.2 作用機(jī)制
        1.3 生理功能
    2. 研究生長軸機(jī)制的意義
    3. 生長激素受體(GHR)和生長激素結(jié)合蛋白(GHBP)
        3.1 ghr結(jié)構(gòu)和mRNA種類
        3.2 GHR蛋白結(jié)構(gòu)
        3.3 GHBP蛋白結(jié)構(gòu)和功能概述
        3.4 GHR的作用機(jī)制
        3.5 ghr表達(dá)的組織特異性和時(shí)空變化
        3.6 ghr表達(dá)水平的調(diào)節(jié)
        3.7 ghr表達(dá)水平與生長的關(guān)系
    4. 胰島素樣生長因子家族(IGFs)
        4.1 IGFs基因和蛋白結(jié)構(gòu)
        4.2 胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)
        4.3 胰島素樣生長因子受體(IGFR)
        4.4 IGFs和IGFR的作用機(jī)制
        4.5 IGF1的生理作用
        4.6 igf1表達(dá)的組織特異性和時(shí)空變化
        4.7 igf1表達(dá)的調(diào)節(jié)
        4.8 igf1表達(dá)與生長的關(guān)系
    5. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR
        5.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理
        5.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)記方法
    6. 研究對(duì)象、意義和技術(shù)路線
        6.1 研究對(duì)象和實(shí)驗(yàn)意義
        6.2 技術(shù)路線
第二章 ghr1和igf1實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的建立
    1. 試驗(yàn)材料
    2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器
        2.1 試劑
            2.1.1 RNA提取相關(guān)試劑
            2.1.2 目的片段回收相關(guān)試劑
            2.1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑
            2.1.4 瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)試劑
            2.1.5 培養(yǎng)基
        2.2. 實(shí)驗(yàn)儀器
    3. 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 羅非魚肝臟和肌肉組織總RNA的提取(Trizol法)
        3.2 cDNA的制備
        3.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備
            3.3.1 目的片段的擴(kuò)增
            3.3.2 目的片段的回收純化
            3.3.3 目的片段與質(zhì)粒載體的連接
            3.3.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備
            3.3.5 感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
            3.3.6 質(zhì)粒抽提和鑒定
        3.4 熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)平臺(tái)的建立
            3.4.1 反應(yīng)體系
            3.4.2 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線
            3.4.3 建立熔解曲線
        3.5 平臺(tái)的初步檢測(cè)
    4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.1 RNA的抽提和鑒定結(jié)果
        4.2 cDNA樣品的制備與檢測(cè)
        4.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備和鑒定
        4.4 擴(kuò)增曲線及熔解曲線分析
        4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
        4.6 目的基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算
            4.6.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的初始拷貝數(shù)
            4.6.2 目的基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算
        4.7 平臺(tái)的初步檢測(cè)結(jié)果
    5. 討論
第三章 不同生長階段尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚肝臟和肌肉中g(shù)hr1和igf1表達(dá)水平的檢測(cè)
    1. 實(shí)驗(yàn)材料和養(yǎng)殖管理
    2. 試劑和儀器
    3. 方法
        3.1 RNA提取和cDNA的制備
        3.2 各組織定量分析
    4. 數(shù)據(jù)分析
    5. 結(jié)果
        5.1 尼羅羅非魚和奧利亞體重的變化
        5.2 尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚肝臟ghr1和igf1表達(dá)量
        5.3 尼羅羅非魚和奧利亞羅非魚肌肉ghr1和igf1表達(dá)量
    6. 討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄 實(shí)驗(yàn)試劑及配置
致謝
科研情況



本文編號(hào)：3912146