發(fā)布時間：2024-01-25 19:43

　　外套膜是貝殼形成的重要器官,按照不同部位結(jié)構(gòu)特征和功能的不同,外套膜從殼頂向殼低方向大致可以分為三個區(qū)域:邊緣膜區(qū)(marginal zone)、套膜區(qū)(pallial zone)、中央膜區(qū)(central zone)。一般認為,邊緣膜區(qū)主要參與棱柱層的形成,套膜區(qū)和中央膜區(qū)主要參與珍珠層的形成。為了探究外套膜中央膜與邊緣膜功能上的差異機制,課題組前期的研究中構(gòu)建了馬氏珠母貝中央膜與邊緣膜mRNA和miRNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,本研究以此為基礎(chǔ),篩選中央膜和邊緣膜差異表達的miRNA,隨后通過mir-RACE技術(shù)驗證篩選miRNA的序列,利用莖環(huán)引物熒光定量技術(shù)檢測篩選miRNA的組織表達差異。通過生物信息學分析篩選miRNA的靶點,并使用雙熒光素酶實驗驗證miRNA與預測靶基因間的靶向關(guān)系。最后通過體內(nèi)miRNA過表達實驗,結(jié)合莖環(huán)引物熒光定量和掃描電鏡觀察,檢測mi RNA對貝殼內(nèi)表面結(jié)構(gòu)及靶基因表達的影響,以此鑒定miRNA的功能及調(diào)控機制。主要研究結(jié)果如下:1.miRNA的篩選和鑒定:通過分析馬氏珠母貝外套膜中央膜與邊緣膜miRNA數(shù)據(jù),從189條已知miRNA中分別篩選出3個邊緣膜...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 馬氏珠母貝簡介
        1.1.1 貝殼形成相關(guān)的生物礦化研究
        1.1.2 外套膜的結(jié)構(gòu)
    1.2 miRNA簡介
        1.2.1 miRNA的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 miRNA的生物學特點
        1.2.3 miRNA的生物合成
        1.2.4 miRNA的作用機制
        1.2.5 miRNA的研究方法
    1.3 研究目的和意義
2 馬氏珠母貝外套膜miRNA的篩選和驗證
    2.1 實驗方法
        2.1.1 中央膜和邊緣膜差異miRNA的篩選
        2.1.2 實驗用貝
        2.1.3 質(zhì)粒、載體和細胞
        2.1.4 實驗所需引物
        2.1.5 主要試劑及設(shè)備
        2.1.6 實驗所需主要溶液、試劑配制方法
        2.1.7 miRNA的提取
        2.1.8 mir-RACE獲得mi RNA序列
        2.1.9 miRNA邊緣膜中央膜組織差異表達分析
    2.2 結(jié)果與分析
        2.2.1 篩選結(jié)果
        2.2.2 mir-RACE模板與克隆條帶分析
        2.2.3 miRNA熒光定量結(jié)果分析
    2.3 討論
3 miRNA功能的研究
    3.1 實驗步驟
    3.2 實驗結(jié)果
        3.2.1 熒光定量結(jié)果
        3.2.2 SEM觀察miRNA過表達效果
    3.3 討論
        3.3.1 miRNA對貝殼形成的影響
4 馬氏珠母貝外套膜miRNA靶點篩選和靶向關(guān)系驗證
    4.1 實驗方法
        4.1.1 靶點的篩選
        4.1.2 靶基因目的片段載體的構(gòu)建
        4.1.3 靶位點突變載體的構(gòu)建
        4.1.4 雙熒光素酶系統(tǒng)實驗驗證miRNA對靶點的調(diào)控
        4.1.5 熒光定量檢測靶基因的表達量
        4.1.6 NPY序列驗證
        4.1.7 miRNA過表達對靶基因的影響
    4.2 結(jié)果與分析
        4.2.1 靶點的篩選
        4.2.2 miRNA過表達對靶基因的影響
        4.2.3 目的片段載體構(gòu)建結(jié)果
        4.2.4 雙熒光素酶實驗
    4.3 討論
        4.3.1 miRNA靶點的篩選
        4.3.2 miRNA對貝類礦化的影響
        4.3.3 miRNA對貝類免疫的影響
5 結(jié)論
參考文獻
致謝
作者簡介
導師簡介



本文編號：3885443