三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是我國重要的淡水育珠蚌之一,育珠插核過程中傷口容易受到病原體侵染,使育珠蚌的吐核率升高,甚至造成蚌的死亡。因此,開展對其分子免疫及傷口修復(fù)機制的研究具有重要的理論和實際意義。本文采用RACE PCR技術(shù)分別克隆出了三角帆蚌的基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)和基質(zhì)金屬蛋白酶-19(MMP-19)的cDNA序列,利用實時熒光定量PCR方法檢測2種基因在健康蚌血淋巴、肝胰臟、閉殼肌、外套膜和鰓5種組織中的表達情況;以及嗜水氣單胞菌和肽聚糖(PGN)刺激后,2種基因在血液和肝胰臟中的表達變化;通過建立三角帆蚌創(chuàng)傷修復(fù)模型,利用實時熒光定量PCR方法檢測2種基因在傷口修復(fù)期間不同時間段的表達情況;利用原核表達技術(shù)對2種基因進行了原核表達。MMP1基因的cDNA全長序列為1822 bp,其中5’UTR(非編碼區(qū))有31 bp;3’UTR有258 bp;開放閱讀框(ORF)的堿基長度為1533 bp,共編碼510個氨基酸。經(jīng)Expasy在線網(wǎng)站的SignalP 4.0分析氨基酸發(fā)現(xiàn)該蛋白含有信號肽序列,該蛋白理論分子量為58.28 kDa,等電點為9....

【文章頁數(shù)】：104 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表
第1章 引言
    1.1 概述
    1.2 MMP的結(jié)構(gòu)、分類和功能
    1.3 MMPs的三級結(jié)構(gòu)
    1.4 MMPs的生物活性分子調(diào)節(jié)
    1.5 MMPs的傷口愈合機制
    1.6 MMPs的研究現(xiàn)狀
    1.7 本研究基因的現(xiàn)狀、目的及意義
第2章 三角帆蚌基質(zhì)金屬蛋白酶MMP1，19 基因克隆及原核表達
    2.1 前言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 實驗材料
        2.2.2 菌株和質(zhì)粒
        2.2.3 主要試劑
        2.2.4 主要試劑盒
        2.2.5 主要儀器設(shè)備
        2.2.6 總RNA的提取
        2.2.7 三角帆蚌SMART cDNA的合成
        2.2.8 HcMMP1基因和HcMMP19基因的克隆
        2.2.9 HcMMPs基因的生物信息學(xué)分析
        2.2.10 HcMMP1和Hc MMP19基因在三角帆蚌不用組織中的表達
        2.2.11 嗜水氣單胞菌和肽聚糖刺激后HcMMP1和HcMMP19基因的表達
        2.2.12 建立三角帆蚌損傷模型
        2.2.13 利用RT- PCR技術(shù)檢測表達變化
        2.2.14 MMP1基因和MMP19基因的原核表達
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 三角帆蚌的總RNA
        2.3.2 HcMMP1和HcMMP19基因的cDNA全長克隆
        2.3.3 HcMMP1和HcMMP19基因cDNA全長序列及推導(dǎo)的氨基酸序列.
        2.3.4 MMPs基因序列的生物信息學(xué)分析
        2.3.5 推導(dǎo)MMPs氨基酸序列的同源性比對
        2.3.6 HcMMPs基因的系統(tǒng)進化樹
        2.3.7 HcMMP1和HcMMP19基因的定量表達
        2.3.8 HcMMPs基因的重組質(zhì)粒的構(gòu)建及在大腸桿菌中的表達及純化
        2.3.9 重組MMP19蛋白濃度測定
    2.4 討論
第3章 結(jié)論與展望
    3.1 結(jié)論
    3.2 展望
致謝
參考文獻
攻讀學(xué)位期間的研究成果



本文編號：3874567