副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是目前備受關(guān)注的人畜共患病的病原,不僅是水生動(dòng)物弧菌病(Vibriosis)的重要病原,而且也是一種常見(jiàn)的食源性致病菌,極易引起食物中毒,嚴(yán)重的可引起腸胃炎等疾病。此外,Vp還可能引發(fā)傷口感染,嚴(yán)重的可導(dǎo)致敗血癥甚至死亡,對(duì)人類健康危害巨大。而斑馬魚作為最重要的模式脊椎動(dòng)物之一,在受精之后的3周時(shí)間內(nèi)只存在“天然免疫”系統(tǒng),具有在器官水平和個(gè)體水平上研究天然免疫應(yīng)答的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)主要以斑馬魚為模型,用Vp感染斑馬魚來(lái)檢測(cè)不同來(lái)源的人類致病株及水產(chǎn)動(dòng)物致病株的毒力大小,得到的強(qiáng)毒力菌株Vp13用于探究Notch信號(hào)分子及炎性因子、細(xì)胞因子及TLR信號(hào)通路上的關(guān)鍵因子在感染斑馬魚胚胎或幼體中的表達(dá)量變化,初步探究Notch分子參與天然免疫應(yīng)答的作用。為了進(jìn)一步探究Notch信號(hào)在Vp感染斑馬魚胚胎中的作用機(jī)制,我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成功獲得了notch1a及notch1b的突變體,為后續(xù)感染機(jī)制的深入研究提供了寶貴材料。本研究的主要成果有:1)本文以Vp為研究對(duì)象,建立了成年斑馬魚的感染模型,對(duì)人類致...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 前言
    1 副溶血弧菌
        1.1 副溶血弧菌引起的疾病
        1.2 影響副溶血弧菌數(shù)量的環(huán)境因子
        1.3 非可培養(yǎng)狀態(tài)
        1.4 副溶血弧菌的致病因素
            1.4.1 耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin，TDH)
            1.4.2 TDH相關(guān)溶血素(TDH-related hemolysin，TRH)
    2 斑馬魚
        2.1 斑馬魚簡(jiǎn)介
        2.2 斑馬魚作為疾病模型的優(yōu)勢(shì)
        2.3 病原菌感染斑馬魚的途徑
        2.4 斑馬魚中參與免疫調(diào)節(jié)的基因
    3 Notch信號(hào)通路
        3.1 Notch信號(hào)通路簡(jiǎn)介
        3.2 Notch基因結(jié)構(gòu)組成
        3.3 Notch信號(hào)通路
        3.4 Notch信號(hào)在先天免疫中的作用
        3.5 Notch信號(hào)在感染性疾病中的作用
    4 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)
        4.1 CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)簡(jiǎn)介
        4.2 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)優(yōu)勢(shì)
        4.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在斑馬魚中的應(yīng)用
第二章 副溶血弧菌感染斑馬魚模型的建立及毒力比較
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)用魚
        1.2 實(shí)驗(yàn)菌株
        1.3 主要試劑
        1.4 主要儀器
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 菌液準(zhǔn)備
        2.2 Vp人工感染斑馬魚的預(yù)實(shí)驗(yàn)
        2.3 Vp人工感染斑馬魚的正式實(shí)驗(yàn)
        2.4 LD50的計(jì)算方法
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.0 預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 ATCC17802 感染斑馬魚LD₅₀的計(jì)算結(jié)果
        3.2 Vp13 感染斑馬魚LD₅₀的計(jì)算結(jié)果
        3.3 ATCC33847 感染斑馬魚LD₅₀的計(jì)算結(jié)果
        3.4 Vp57 感染斑馬魚LD₅₀的計(jì)算結(jié)果
        3.5 Vp31 感染斑馬魚LD₅₀的計(jì)算結(jié)果
        3.6 Vp41 感染斑馬魚LD₅₀的計(jì)算結(jié)果
        3.7 不同計(jì)算方法比較各菌株毒力結(jié)果
    4 討論
第三章 Q-PCR檢測(cè)Notch信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)量變化
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 主要試劑
        1.2 主要儀器
        1.3 實(shí)驗(yàn)材料
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 菌液準(zhǔn)備
        2.2 斑馬魚卵及幼魚的浸泡感染
        2.3 Trizol法提取胚胎的總RNA
        2.4 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA
        2.5 熒光定量PCR(Q-PCR)檢測(cè)Notch信號(hào)通路基因的變化
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    4 討論
第四章 利用CRISPR/Cas9 基因敲除技術(shù)制備notch1a、notch1b突變體
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.2 主要試劑
        1.3 主要儀器
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 靶位點(diǎn)的選擇原則
        2.2 gRNA合成
        2.3 Cas9 mRNA合成
        2.4 制備F0 斑馬魚與靶點(diǎn)突變效率檢測(cè)
        2.5 檢測(cè)F0 代斑馬魚生殖細(xì)胞對(duì)突變的遺傳(germline transmission)
        2.6 篩選攜帶靶位點(diǎn)突變的F1 代成魚斑馬魚
        2.7 篩選F2 代notch1a突變的純合子斑馬魚
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 notch1a突變體制備
            3.1.1 F0- notch1a基因敲除檢測(cè)結(jié)果
            3.1.2 F0- notch1a germline transmition檢測(cè)結(jié)果
            3.1.3 notch1a F1 代突變體成年斑馬魚檢測(cè)
            3.1.4 notch1a突變體F2 代純合子篩選
        3.2 notch1b基因敲除
            3.2.1 F0- notch1b基因敲除檢測(cè)
            3.2.2 F0- notch1b-001 germline transmission檢測(cè)
            3.2.3 notch1b F1 代突變體成年斑馬魚檢測(cè)
            3.2.4 notch1b突變體F2 代純合子篩選
    4.討論
全文總結(jié)及展望
參考文獻(xiàn)
致謝



本文編號(hào)：3870703