青蝦,學(xué)名日本沼蝦(Macrobrachium nipponense),是我國重要的淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)蝦類。其在分類上屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda),甲殼綱(Crustacea),十足目(Decapoda),長臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium)。近年來,隨著青蝦遺傳育種工作的開展,已有大量與性別和生殖相關(guān)的基因被克隆并進(jìn)行了表達(dá)分析,但是對于這些基因的功能研究仍缺少有效的手段。RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)是一種重要的基因功能研究手段,已在多種甲殼動物功能基因的研究中應(yīng)用,然而該技術(shù)在青蝦研究工作中的應(yīng)用還鮮有報道。在青蝦中建立RNAi的方法,將為青蝦基因功能的研究開辟一條新的路徑。本研究用實(shí)驗(yàn)室已克隆的青蝦transformer-2(Mntra-2)基因進(jìn)行青蝦RNAi技術(shù)的研究,然后將RNAi技術(shù)應(yīng)用到新克隆的青蝦蛻皮抑制激素(molt-inhibiting hormone, MIH)基因的功能研究中。在Mntra-2基因中研究了RNAi的最佳注射部位、注射劑量以及干擾規(guī)律。通過對肌肉、心臟、圍心腔和眼柄基部四...

【文章頁數(shù)】：83 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文獻(xiàn)綜述
    第一節(jié) RNA干擾技術(shù)簡介及其在甲殼動物研究中的應(yīng)用
        1 RNAi的簡介
            1.1 RNAi的發(fā)現(xiàn)
            1.2 RNAi的作用機(jī)制及特點(diǎn)
            1.3 RNAi所需dsRNA或siRNA的合成原則
            1.4 RNAi的導(dǎo)入方法
                1.4.1 注射法
                1.4.2 飼喂法
                1.4.3 浸泡法
                1.4.4組織培養(yǎng)法
        2 RNAi在甲殼動物中的應(yīng)用
            2.1 功能基因的研究
            2.2 抗病毒研究
        3 RNAi前景展望
    第二節(jié) MIH基因和tra-2基因的研究概況
        1 MIH基因研究概況
            1.1 MIH基因簡介
            1.2 MIH基因的結(jié)構(gòu)
            1.3 MIH基因的作用機(jī)理
            1.4 MIH基因的功能及研究方法
        2 transformer 2(tra-2)基因研究概況
    第三節(jié) 本研究的目的與意義
第二章 青蝦RNAi方法的研究
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)用蝦
        1.2 試劑和儀器
    2 dsRNA的準(zhǔn)備
        2.1 青蝦總RNA的提取
            2.1.1 實(shí)驗(yàn)用品的預(yù)處理
            2.1.2 總RNA的提取
            2.1.3 總RNA的質(zhì)量檢測和濃度測定
        2.2 反轉(zhuǎn)錄
        2.3 制備dsRNA所用引物設(shè)計
        2.4 開放閱讀框片段的擴(kuò)增
        2.5 PCR產(chǎn)物的回收、測序
        2.6 dsRNA的合成
        2.7 dsRNA的純化
        2.8 dsRNA的質(zhì)量檢測和濃度測定
    3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.1 注射部位篩選
        3.2 時間依賴性干擾試驗(yàn)
        3.3 不同劑量干擾試驗(yàn)
    4 RNA提取及熒光定量PCR檢測
        4.1 RNA的提取
        4.2 cDNA第一鏈的合成
        4.3 RT-PCR反應(yīng)
        4.4 Real-time熒光定量PCR分析
    5 數(shù)據(jù)處理
    6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.1 最適注射部位篩選結(jié)果
        6.2 時間依賴性干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        6.3 不同劑量干擾效果比較
    7 討論
        7.1 注射部位的選擇分析
        7.2 不同注射劑量的干擾效果的分析
        7.3 不同劑量的干擾規(guī)律
第三章 RNAi技術(shù)在青蝦蛻皮抑制激素(MIH)基因功能研究中的應(yīng)用
    第一節(jié) 青蝦MIH基因全長cDNA的克隆及序列分析
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)蝦
            1.2 主要試劑和儀器
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 青蝦眼柄總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄
            2.2 青蝦MIH cDNA基因擴(kuò)增所用引物設(shè)計
            2.3 中間片段的擴(kuò)增
            2.4 青蝦MIH基因的3'RACE
                2.4.1 3'端反轉(zhuǎn)錄
                2.4.2 3'端擴(kuò)增
            2.5 青蝦MIH基因的5'RACE
                2.5.1 5'RACE cDNA模板的制備
                2.5.2 5'端擴(kuò)增
            2.6 PCR產(chǎn)物的克隆
            2.7 序列的測定及分析
        3 結(jié)果與分析
            3.1 青蝦眼柄總RNA提取結(jié)果
            3.2 青蝦MIH部分片段、3'端和5'端的分離
            3.3 青蝦MIH基因全長cDNA序列結(jié)構(gòu)特征
            3.4 同源性分析
            3.5 系統(tǒng)發(fā)育分析
        4 討論
    第二節(jié) 青蝦MIH基因的時空表達(dá)分析
        1 實(shí)驗(yàn)材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)蝦
            1.2 主要試劑和儀器
        2 實(shí)驗(yàn)方法
            2.1 引物設(shè)計及檢驗(yàn)
            2.2 組織RNA的提取
            2.3 cDNA第一鏈的合成
            2.4 RT-PCR反應(yīng)及分析
        3 結(jié)果
            3.1 青蝦各樣本總RNA的檢測
            3.2 MnMIH基因在青蝦胚胎發(fā)育期、幼體發(fā)育期和幼蝦發(fā)育期的表達(dá)
            3.3 青蝦MIH基因在成體不同組織中的表達(dá)
            3.4 MnMIH基因在青蝦蛻皮周期中表達(dá)差異結(jié)果
        4 討論
            4.1 不同發(fā)育時期表達(dá)差異
            4.2 成體不同組織表達(dá)差異
            4.3 蛻皮周期表達(dá)水平差異
    第三節(jié) 利用RNAi技術(shù)對青蝦MIH基因功能的研究
        1 材料與方法
            1.1 實(shí)驗(yàn)蝦
            1.2 dsRNA的制備
            1.3 體外dsRNA的注射
            1.4 RNA提取及檢測所用試劑和材料
            1.5 RT-PCR反應(yīng)和結(jié)果分析
        2 結(jié)果
            2.1 一次性RNAi對基因表達(dá)量的影響
            2.2 連續(xù)性RNAi對青蝦蛻皮頻次和體重的影響
        3 討論
            3.1 RNAi對MIH表達(dá)量的影響
            3.2 RNAi對青蝦蛻皮頻次和體重的影響
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄 實(shí)驗(yàn)試劑及配置
致謝
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本文編號：3826342