細菌性疾病是海水養(yǎng)殖魚類最主要的一類疾病,但鑒定病原所需的傳統(tǒng)微生物學(xué)方法常常受到場地和時間的限制,近年來,分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速,由此衍生的分子診斷方案具有更強的特異性和敏感性,也是目前快速檢測病原行之有效的方法。本研究以輪蟲弧菌(Vibrio rotiferianus)和美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種(Photobacterium damselae subsp.damselae)為對象,依次建立了這兩種病原菌的微流控?zé)晒舛縋CR和重組酶聚合酶擴增(RPA)檢測方法。主要研究結(jié)果如下:1.基于tox R基因的輪蟲弧菌(Vibrio rotiferianus)微流控?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立以輪蟲弧菌(Vibrio rotiferianus)的單拷貝tox R基因的高保守區(qū)域為目的片段,設(shè)計特異性引物,構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,建立針對該菌的熒光定量PCR檢測方法。以此為基礎(chǔ),選用UF-150 Genechecker微流控?zé)晒舛縋CR儀,通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件,建立了輪蟲弧菌的微流控?zé)晒舛縋CR檢測方法。該方法能特異性擴增tox R基因目的片段,對輪蟲弧菌純培養(yǎng)物檢測下限為1.34×1...

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
引言
第一章 文獻綜述
    1.1 兩種新發(fā)海水養(yǎng)殖病原研究進展
        1.1.1 輪蟲弧菌
        1.1.2 美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種
    1.2 水產(chǎn)養(yǎng)殖病害病原菌常用檢測方法
        1.2.1 微流控?zé)晒舛縋CR檢測技術(shù)
        1.2.2 重組酶聚合酶擴增技術(shù)
    1.3 細菌檢測常用靶基因
        1.3.1 用于細菌分類的靶基因
            1.3.1.1 16SrDNA基因
            1.3.1.2 16S²3SrDNA基因
            1.3.1.3 gyrB基因
        1.3.2 特有基因
            1.3.2.1 toxR基因
            1.3.2.2 Mcp基因和Dly基因
    1.4 本研究的目的和意義
第二章 基于tox R基因的輪蟲弧菌(Vibrio rotiferianus)微流控?zé)晒舛縋CR檢測方法的建立
    2.1 實驗材料
        2.1.1 實驗用菌株
        2.1.2 試劑和試劑盒
        2.1.3 儀器和設(shè)備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 菌株活化和DNA提取
        2.2.2 輪蟲弧菌引物設(shè)計
        2.2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建
        2.2.4 反應(yīng)條件和反應(yīng)體系優(yōu)化
        2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        2.2.6 特異性試驗
        2.2.7 敏感性試驗
        2.2.8 微流控檢測方法的建立
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建
        2.3.2 反應(yīng)體系和條件優(yōu)化
        2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        2.3.4 引物的特異性和敏感性
        2.3.5 微流控檢測方法的建立及應(yīng)用
    2.4 討論
    2.5 本章小結(jié)
第三章 美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種(Photobacterium damselae subsp.damselae)強致病力菌株的快速檢測技術(shù)
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株
        3.1.2 試劑和試劑盒
        3.1.3 儀器和設(shè)備
    3.2 實驗方法
        3.2.1 實驗菌株活化和DNA提取
        3.2.2 特異性引物的設(shè)計
        3.2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備
        3.2.4 反應(yīng)體系和條件優(yōu)化
        3.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.2.6 特異性試驗
        3.2.7 敏感性試驗
        3.2.8 微流控檢測方法的建立與應(yīng)用
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建
        3.3.2 反應(yīng)體系和條件優(yōu)化
        3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
        3.3.4 引物的特異性和敏感性
        3.3.5 微流控檢測方法的建立及應(yīng)用
    3.4 討論
    3.5 本章小結(jié)
第四章 基于重組酶聚合酶擴增技術(shù)(RPA)快速檢測輪蟲弧菌和美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 試劑和試劑盒
        4.1.3 儀器和設(shè)備
    4.2 實驗方法
        4.2.1 樣本采集和DNA提取
        4.2.2 RPA引物的設(shè)計
        4.2.3 RPA反應(yīng)體系和條件優(yōu)化
        4.2.4 RPA引物的特異性試驗
        4.2.5 RPA在不同反應(yīng)條件的比較
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 RPA引物的特異性試驗
        4.3.2 RPA在不同反應(yīng)條件的比較
    4.4 討論
        4.4.1 基于RPA技術(shù)快速檢測輪蟲弧菌
        4.4.2 基于RPA技術(shù)快速檢測美人魚發(fā)光桿菌美人魚亞種
    4.5 本章小結(jié)
第五章 全文總結(jié)
參考文獻
攻讀碩士期間科研成果
致謝



本文編號：3825472