白斑綜合癥是危害世界蝦養(yǎng)殖業(yè)的一大危害,自1992年在中國臺灣發(fā)現(xiàn)以來,隨后迅速在亞洲、歐洲、美洲蔓延開來。一旦感染白斑綜合癥病毒(WSSV),對蝦3-10天發(fā)病,且死亡率100%,至今仍沒有針對WSSV有效治療方法。目前只能以清潔養(yǎng)殖環(huán)境、篩選抗病毒蝦苗、使用一般的抗病毒藥等手段預(yù)防WSSV感染。自WSSV基因組測序工作完成以來,越來越多的研究重點(diǎn)放在WSSV感染宿主細(xì)胞致病機(jī)理上,并且已經(jīng)證明病毒囊膜蛋白在感染宿主的過程中起到了關(guān)鍵性作用,其中囊膜蛋白VP28研究居多。VP28蛋白已經(jīng)在多種真核、原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并被證明能夠有效的抵御WSSV感染,所以重組VP28蛋白疫苗可作為防治白斑綜合癥的一種新手段。大腸桿菌中表達(dá)的VP28蛋白需要提取純化后才能施用,這會增加成本和技術(shù)難度,對于規(guī)�；B(yǎng)殖中應(yīng)用推廣是十分不利的。藍(lán)藻為光合自養(yǎng)生物,結(jié)構(gòu)簡單,基因組小便于遺傳操作,蛋白酶含量少不易分解外源表達(dá)產(chǎn)物,光合效率高,生長速度快,且個體為多細(xì)胞易于大量收獲。因此,藍(lán)藻作為原核表達(dá)系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于制備重組藥物、生物柴油和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域。對蝦仔蝦期具有植食性階段,藍(lán)藻為天然開口餌料,故藍(lán)...

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
    1 白斑綜合癥病毒（WSSV）防治及囊膜蛋白VP28研究進(jìn)展
        1.1 白斑綜合癥病毒
        1.2 WSSV防治的研究
        1.3 WSSV囊膜蛋白VP28
    2 藍(lán)藻基因工程和魚腥藻7120的研究
        2.1 藍(lán)藻基因工程
        2.2 魚腥藻 7120
    3 外源基因表達(dá)量定量方法的和單克隆抗體研究
        3.1 RT-qPCR
        3.2 ELISA
        3.3 Western Blotting
        3.4 單克隆抗體
    4 本研究的目的、內(nèi)容及意義
第一章 VP28基因原核表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)及純化
    1 材料
        1.1 菌株和質(zhì)粒
        1.2 試劑與儀器
    2 方法
        2.1 目的基因的合成
        2.2 目的序列的擴(kuò)增
        2.3 目的片段與表達(dá)載體的連接
        2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        2.5 陽性克隆鑒定
        2.6 重組質(zhì)粒的雙酶切和質(zhì)粒電泳
        2.7 DNA測序
        2.8 重組質(zhì)粒pET-28a-vp28轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)
        2.9 IPTG誘導(dǎo)融合蛋白的表達(dá)
        2.10 表達(dá)產(chǎn)物分布的確定
        2.11 融合蛋白的純化
        2.12 純化后蛋白的濃度測定
    3 結(jié)果
        3.1 目的序列的擴(kuò)增
        3.2 目的片段與表達(dá)載體的連接
        3.3 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
        3.4 陽性克隆的鑒定
        3.5 重組質(zhì)粒雙酶切和質(zhì)粒電泳
        3.6 測序結(jié)果
        3.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)
        3.8 SDS-PAGE檢測誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白
        3.9 表達(dá)產(chǎn)物的分布
        3.10 融合蛋白的純化
        3.11 SDS-PAGE檢測純化后的融合蛋白
        3.12 純化后蛋白濃度的測定
    討論
第二章 抗VP28單克隆抗體的制備
    1 材料
    2 方法
        2.1 抗原的設(shè)計(jì)與制備
        2.2 免疫小鼠
        2.3 細(xì)胞融合與陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選
        2.4 腹水的制備
        2.5 ELISA法測定效價(jià)、表位信息和抗體分型
    3 結(jié)果
        3.1 抗原表位的設(shè)計(jì)與選取
        3.2 免疫鼠抗體的生產(chǎn)與ELISA檢測
        3.3 雜交瘤細(xì)胞的篩選與腹水制備
        3.4 ELISA法測定單抗分型、效價(jià)和表位信息
    討論
第三章 外源蛋白表達(dá)量的定量檢測
    1 材料
        1.1 藻種
        1.2 儀器
        1.3 試劑
    2 方法
        2.1 野生型和轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120的固體分離與純化
        2.2 轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120的液體培養(yǎng)
        2.3 抗生素篩選轉(zhuǎn)基因魚腥藻 7120
        2.4 野生型和轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120的生長曲線
        2.5 轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120總蛋白樣品的制備
        2.6 總蛋白濃度的測定
        2.7 不同生長時期轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120中VP28表達(dá)量的測定
    3 結(jié)果
        3.1 野生型和轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120的固體分離與純化
        3.2 轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120的液體培養(yǎng)和抗生素下的篩選
        3.3 總蛋白樣品的制備
        3.4 轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120的總蛋白濃度
        3.5 野生型和轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120的生長曲線
        3.6 不同生長時期的轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120中VP28表達(dá)量
    討論
全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士期間的主要科研成績
致謝



本文編號：3821312