我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國,近年來隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大,養(yǎng)殖病害日益凸顯,如何有效預(yù)防病害的發(fā)生、提升養(yǎng)殖品種抗病性能,是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要課題。免疫系統(tǒng)是個體抵御外來病原入侵的有效防線,對養(yǎng)殖品種免疫機制的深入研究,不僅有助于我們更好地理解養(yǎng)殖對象的免疫反應(yīng)機理,也將為細(xì)菌性疾病防控提供科學(xué)依據(jù)。本論文首先基于中華絨螯蟹全基因組測序數(shù)據(jù)庫和大量轉(zhuǎn)錄組文庫獲得了EsDAZAP2的部分開放閱讀框(ORF)序列,通過RACE技術(shù)擴增得到EsDAZAP2基因cDNA全長。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)DAZAP2在不同物種間相對保守,且均具有特征功能域和基序。進一步的研究發(fā)現(xiàn)EsDAZAP2在中華絨螯蟹不同組織中均有表達,金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌均能誘導(dǎo)EsDAZAP2在血細(xì)胞中的顯著表達上調(diào),暗示該基因可能與免疫反應(yīng)有關(guān)。為明確EsDAZAP2是否參與中華絨螯蟹固有免疫反應(yīng),我們通過RNAi技術(shù)敲降了EsDAZAP2基因并細(xì)菌刺激,結(jié)果發(fā)現(xiàn)EsDAZAP2敲降的中華絨螯蟹具有更高的細(xì)菌易感性,血淋巴中細(xì)菌的cfu也有極顯著上升,表明EsDAZAP2在中華絨螯蟹抗菌免疫反應(yīng)過程中具有重要作用。作為細(xì)胞內(nèi)蛋...

【文章頁數(shù)】：102 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 文獻綜述
    第一節(jié) 甲殼動物的先天免疫的組成及其相關(guān)抗菌因子
        1.1 前言
        1.2 第一道防線：角質(zhì)層和上皮
        1.3 模式識別
        1.4 凝集素
        1.5 血細(xì)胞和造血作用
        1.6 抗病毒反應(yīng)
        1.7 RNA干擾或注射dsRNA誘導(dǎo)抗病毒活性
        1.8 凝血反應(yīng)
        1.9 抗菌蛋白
        1.10 酚氧化酶原激活系統(tǒng)
        1.11 結(jié)論
    第二節(jié) 調(diào)控甲殼動物先天免疫的主要信號通路
        2.1 Toll信號通路
        2.2 Imd信號通路
        2.3 JAK/STAT信號通路
    第三節(jié) Hippo信號通路的研究進展
        3.1 Hippo信號通路的核心組成部分
        3.2 Hippo信號通路的功能
    第四節(jié) 本課題研究目的、意義及研究方案
        5.1 研究目的及意義
        5.2 研究方案
第二章 EsDAZAP2 參與中華絨螯蟹的先天免疫反應(yīng)
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 材料與方法
        2.1 中華絨螯蟹的飼養(yǎng)
        2.2 細(xì)菌刺激
        2.3 RNA的提取
        2.4 模板的制備
        2.5 基因克隆
        2.6 生物信息學(xué)分析
        2.7 實時熒光定量PCR
        2.8 RNA干擾
        2.9 存活率實驗
        2.10 細(xì)菌清除實驗
        2.11 免疫熒光實驗
    第三節(jié) 結(jié)果
        3.1 EsDAZAP2 基因全長的獲得
        3.2 EsDAZAP2 基因的生物信息學(xué)分析
        3.3 EsDAZAP2 基因的各組織表達模式
        3.4 EsDAZAP2 基因的不同菌刺激表達模式
        3.5 EsDAZAP2 基因的干擾對中華絨螯蟹存活率的影響
        3.6 EsDAZAP2 基因的干擾對中華絨螯蟹血細(xì)胞清除細(xì)菌能力的影響
        3.7 EsDAZAP2 基因的干擾對抗菌肽表達的影響
        3.8 EsDAZAP2 基因的干擾對三種入核因子的影響
    第四節(jié) 討論
第三章 酵母雙雜交文庫的構(gòu)建以及篩選EsDAZAP2 相互作用的蛋白
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 材料與方法
        2.1 中華絨螯蟹血細(xì)胞RNA的提取
        2.2 初級文庫的構(gòu)建
        2.3 次級文庫的構(gòu)建
        2.4 誘餌質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.5 酵母雙雜交mating篩庫
        2.6 免疫共沉淀實驗
        2.7 免疫印跡Western Blot
    第三節(jié) 結(jié)果
        3.1 初級文庫質(zhì)量鑒定
        3.2 次級文庫質(zhì)量鑒定
        3.3 酵母轉(zhuǎn)化效率
        3.4 誘餌蛋白的自激活檢測
        3.5 EsDAZAP與 EsSav相互作用
    第四節(jié) 討論
第四章 Hippo信號通路參與調(diào)節(jié)抗菌肽
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 材料與方法
        2.1 基因克隆
        2.2 Western Blot
        2.3 免疫熒光
        2.4 RNA干擾
        2.5 實時熒光定量PCR
    第三節(jié) 結(jié)果
        3.1 Hippo通路成員的鑒定
        3.2 細(xì)菌刺激對EsHpo磷酸化以及EsYki細(xì)胞定位的影響
        3.3 干擾EsHpo對 EsYki細(xì)胞定位的影響
        3.4 干擾EsHpo對中華絨螯蟹的存活率及細(xì)菌清除能力的影響
        3.5 干擾EsHpo對抗菌肽的影響
        3.6 干擾EsHpo對 Dorsal入核的影響
        3.7 干擾EsYki對 EsCact轉(zhuǎn)錄水平的影響
    第四節(jié) 討論
第五章 EsDAZAP2與EsSav相互作用并參與調(diào)控Hippo信號通路
    第一節(jié) 前言
    第二節(jié) 材料與方法
        2.1 樣品處理
        2.2 Western Blot
        2.3 免疫熒光
        2.4 RNA干擾
        2.5 免疫共沉淀
    第三節(jié) 結(jié)果
        3.1 干擾EsDAZAP2對EsHpo磷酸化的影響
        3.2 干擾EsDAZAP2對EsYki細(xì)胞定位的影響
        3.3 EsDAZAP2與EsSav相互作用的結(jié)構(gòu)域
    第四節(jié) 討論
本研究的結(jié)論、特色與創(chuàng)新點
    1.本研究的結(jié)論
    2.特色
    3.創(chuàng)新點
參考文獻
攻讀博士學(xué)位期間完成與發(fā)表的學(xué)術(shù)論文
致謝



本文編號：3816799