發(fā)布時間：2023-04-29 19:14

　　中國大鯢(Andrias davidianus)是我國珍稀的名貴特產(chǎn),也是目前世界上個體最大的兩棲類動物。由于大鯢屬于野生動物從水生向陸生過渡的物種,因此在研究物種起源、進(jìn)化、生物多樣性、基因變異等方面具有重要的科學(xué)意義。不僅如此,大鯢還具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值。近年來,隨著我國大鯢養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,大鯢虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus)所引起的病毒性疾病給大鯢的養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。因而開展大鯢抗病毒防御機(jī)制的研究對其病毒性疾病的防控具有重要意義。干擾素(Interferon,IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能的細(xì)胞因子。目前除模式生物非洲爪蟾外,其他兩棲類動物的Ⅰ型干擾素基因的抗病毒功能鮮有研究。本文克隆與分析了大鯢Ⅰ型干擾素c DNA全長及基因組結(jié)構(gòu),在細(xì)胞水平上驗證其抗病毒功能,旨在為研究大鯢免疫防御系統(tǒng)與抗病毒感染機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1.以中國大鯢腎臟組織總RNA為模板,利用RACE PCR技術(shù)克隆得到大鯢Ⅰ型干擾素(gs IFN)c DNA全長,其全長1113 bp,編碼186個氨基酸。氨基酸...

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略語表（按字母順序排列）
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 Ⅰ型干擾素研究進(jìn)展
        1.1 Ⅰ型干擾素的分子結(jié)構(gòu)
        1.2 Ⅰ型干擾素的分泌
        1.3 Ⅰ型干擾素的受體和信號通路
            1.3.1 Ⅰ型干擾素受體
            1.3.2 Ⅰ型干擾素信號通路
        1.4 Ⅰ型干擾素生物學(xué)活性
            1.4.1 抗病毒作用
            1.4.2 免疫調(diào)節(jié)功能
            1.4.3 抑制細(xì)胞增殖與抗腫瘤活性
            1.4.4 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
            1.4.5 Ⅰ型干擾素的應(yīng)用
    2 中國大鯢虹彩病毒研究進(jìn)展
        2.1 大鯢虹彩病毒的發(fā)現(xiàn)
        2.2 大鯢虹彩病毒病的流行特征與臨床癥狀
        2.3 大鯢虹彩病毒理化特性與生物學(xué)特性
        2.4 大鯢虹彩病毒檢測方法
            2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)
            2.4.2 分子生物學(xué)檢測
            2.4.3 電鏡觀察
            2.4.4 免疫學(xué)檢測
        2.5 大鯢虹彩病毒病的防控
    3 兩棲類動物抗病毒免疫的研究
        3.1 兩棲動物免疫系統(tǒng)
            3.1.1 非特異性免疫系統(tǒng)
            3.1.2 特異性免疫系統(tǒng)
        3.2 非洲爪蟾對病毒的免疫應(yīng)答
        3.3 蠑螈對病毒的免疫應(yīng)答
        3.4 虹彩病毒的免疫逃逸策略
    4 研究目的與意義
第二章 大鯢Ⅰ型干擾素基因的克隆與生物信息學(xué)分析
    1 材料和方法
        1.1 實(shí)驗材料
            1.1.1 實(shí)驗動物和菌種
            1.1.2 實(shí)驗試劑和耗材
            1.1.3 實(shí)驗儀器和設(shè)備
        1.2 實(shí)驗方法
            1.2.1 大鯢組織樣品總RNA和總DNA的提取
                1.2.1.1 大鯢腎臟組織總RNA的提取
                1.2.1.2 大鯢肝臟組織總DNA的提取
            1.2.2 5’-RACE和 3’-RACE末端c DNA合成
            1.2.3 RACE法擴(kuò)增大鯢TypeⅠIFN基因c DNA全長
            1.2.4 染色體步移技術(shù)擴(kuò)增大鯢TypeⅠIFN基因全長
            1.2.5 生物信息學(xué)分析
    2 實(shí)驗結(jié)果
        2.1 大鯢TypeⅠIFN (gs IFN) 的核苷酸序列和氨基酸序列分析
        2.2 gs IFN基因結(jié)構(gòu)分析
        2.3 gs IFN氨基酸多重序列比對分析
        2.4 gs IFN氨基酸進(jìn)化樹分析
    3 討論
第三章 大鯢Ⅰ型干擾素的組織表達(dá)分布與誘導(dǎo)表達(dá)
    1 材料和方法
        1.1 實(shí)驗材料
            1.1.1 實(shí)驗動物
            1.1.2 細(xì)胞和病毒
            1.1.3 實(shí)驗試劑和耗材
            1.1.4 實(shí)驗儀器和設(shè)備
        1.2 實(shí)驗方法
            1.2.1 大鯢虹彩病毒GSIV的培養(yǎng)與滴度測定
            1.2.2 各組織RNA的提取和c DNA合成
            1.2.3 gs IFN熒光定量引物的設(shè)計和合成
            1.2.4 熒光定量PCR檢測gs IFN在各組織中的分布
            1.2.5 大鯢外周血白細(xì)胞 (peribheral blood leucocytes, PBLs) 的分離
            1.2.6 Poly I:C和大鯢虹彩病毒 (GSIV) 體外誘導(dǎo)PBLs中g(shù)s IFN的表達(dá)
            1.2.7 數(shù)據(jù)分析
    2 實(shí)驗結(jié)果
        2.1 gs IFN熒光定量引物篩選
        2.2 熒光定量檢測gs IFN在大鯢各組織表達(dá)分布
        2.3 熒光定量檢測poly I:C誘導(dǎo)大鯢PBLs中g(shù)s IFN表達(dá)
        2.4 熒光定量檢測GSIV誘導(dǎo)大鯢PBLs中g(shù)s IFN表達(dá)
    3 討論
第四章 大鯢Ⅰ型干擾素真核表達(dá)載體的構(gòu)建及功能研究
    1 材料與方法
        1.1 材料
            1.1.1 細(xì)胞和病毒
            1.1.2 實(shí)驗試劑和耗材
            1.1.3 實(shí)驗儀器和設(shè)備
        1.2 實(shí)驗方法
            1.2.1 引物的設(shè)計和合成
            1.2.2 真核表達(dá)質(zhì)粒p EGFP-N1-IFN的構(gòu)建
                1.2.2.1 gs IFN ORF片段擴(kuò)增
                1.2.2.2 p MD19-T-IFN和真核表達(dá)質(zhì)粒p EGFP-N1雙酶切與鏈接
                1.2.2.3 轉(zhuǎn)染用真核表達(dá)質(zhì)粒的制備
            1.2.3 真核表達(dá)質(zhì)粒p EGFP-N1-IFN轉(zhuǎn)染GS-M細(xì)胞與細(xì)胞篩選
                1.2.3.1 GS-M細(xì)胞轉(zhuǎn)染
                1.2.3.2 GS-M轉(zhuǎn)染陽性克隆篩選
            1.2.4 GS-M中過表達(dá)gs IFN后抗病毒功能研究
                1.2.4.1 熒光定量檢測GSIV感染過表達(dá)細(xì)胞后相關(guān)基因的表達(dá)
                1.2.4.2 間接熒光免疫檢測GSIV感染過表達(dá)細(xì)胞MCP蛋白的表達(dá)
            1.2.5 數(shù)據(jù)分析
    2 實(shí)驗結(jié)果
        2.1 p EGFP-N1-IFN表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.1.1 gs IFN基因ORF的擴(kuò)增
            2.1.2 陽性克隆的篩選與酶切鑒定
            2.1.3 重組質(zhì)粒p EGFP-N1-IFN轉(zhuǎn)染GS-M細(xì)胞
        2.2 過表達(dá)細(xì)胞感染GSIV后Mx基因的表達(dá)
        2.3 gs IFN過表達(dá)細(xì)胞感染GSIV細(xì)胞形態(tài)觀察
        2.4 gs IFN抑制GSIV病毒在GS-M細(xì)胞中增殖
            2.4.1 熒光定量檢測病毒MCP和IE-ICP46基因表達(dá)
            2.4.2 GSIV病毒滴度的測定
            2.4.3 間接熒光免疫檢測MCP蛋白的表達(dá)
    3 討論
總結(jié)
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝



本文編號：3805580