池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)產(chǎn)于日本滋賀縣的琵琶湖,比其它淡水珍珠蚌具有更好的抗病能力。本研究以淡水貝池蝶蚌為實驗對象采用RACE PCR方法獲得了其親環(huán)素蛋白家族(Cyps)中CyPD、CyPC和CyPH的cDNA基因全長:池蝶蚌CyPD基因cDNA(Gen Bank注冊號:KJ747387。)全長為2671bp,5’-非翻譯區(qū)(Untranslated Region,UTR)80bp,其中3’-UTR 1487bp包括一個多聚腺苷信號AAATAA和Poly(A)尾巴,1104bp的開放性閱讀框(Open reading frame,ORF)編碼367個氨基酸,分子量約為41.09kDa,理論等電點pI=5.43;池蝶蚌CyPC基因cDNA全長為2050bp,5’-UTR 89bp,其中3’-UTR 500bp包括一個多聚腺苷信號AAAATAA和Poly(A)尾巴,1461bp的ORF編碼486個氨基酸,分子量約為55.93kDa,理論等電點pI=6.07;池蝶蚌CyPH基因cDNA(Gen Bank注冊號為KJ747386。)全長為761bp,5’-UTR 7...

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
本研究所用儀器設(shè)備及試劑
第1章 文獻綜述
    1.1 親環(huán)蛋白介紹
    1.2 親環(huán)蛋白的分類
    1.3 親環(huán)蛋白相關(guān)亞型的研究
        1.3.1 CypA的相關(guān)研究
        1.3.2 CyPB的相關(guān)研究
        1.3.3 CyPD的相關(guān)研究
    1.4 本研究的內(nèi)容、目的和意義
第2章 池蝶蚌CyPC、D、H的分子特征分析
    2.1 實驗材料和方法
        2.1.1 實驗材料
        2.1.2 RNA提取
        2.1.3 RNA的質(zhì)量檢測
        2.1.4 SMART cDNA的合成
        2.1.5 CyPC/CyPD/CyPH部分片段的獲取
        2.1.6 RACE PCR的方法克隆基因全長
        2.1.7 PCR產(chǎn)物檢測、目的片段的回收、挑克隆與測序
        2.1.8 CyPC/CyPD/CyPH全長序列及開放閱讀框拼接和分析
    2.2 生物信息學(xué)分析
        2.2.1 開放閱讀框和信號肽位點分析
        2.2.2 蛋白一級結(jié)構(gòu)序列的基本分析
        2.2.3 蛋白二級結(jié)構(gòu)和同源建模
        2.2.4 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        2.2.5 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育分析
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 RNA檢測
        2.3.2 池蝶蚌CyP C、D、H基因cDNA全長核酸序列分析
        2.3.3 池蝶蚌CyP C、D、H蛋白結(jié)構(gòu)分析
            2.3.3.1 一級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析
            2.3.3.2 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析
            2.3.3.3 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測及分析
        2.3.4 池蝶蚌CyP C、D、H與其他物種CyPC、D、H的同源性
        2.3.5 系統(tǒng)發(fā)育分析
    2.4 討論
第3章 池蝶蚌CyPA、B組織表達分析
    3.1 實驗材料和方法
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 池蝶蚌cDNA合成
            3.1.2.1 RNA的提取
            3.1.2.2 RNA質(zhì)量的檢測
            3.1.2.3 RNA的DNaseI處理
            3.1.2.4 cDNA的合成
        3.1.3 池蝶蚌不同組織CyPA、B基因的表達
            3.1.3.1 熒光定量PCR引物設(shè)計
            3.1.3.2 池蝶蚌CyPA、CyPB熒光定量PCR檢測
        3.1.4 目的片段cDNA的克隆
            3.1.4.1 目的表達片段的引物設(shè)計
            3.1.4.2 PCR體系以及所需反應(yīng)的條件
            3.1.4.3 PCR擴增產(chǎn)物的檢測和PCR產(chǎn)物切膠回收純化
        3.1.5 池蝶蚌pET-32a-CyPB重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
            3.1.5.1 目的片段與表達載體的鏈接
            3.1.5.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            3.1.5.3 陽性重組質(zhì)粒的篩選
            3.1.5.4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
        3.1.6 重組蛋白的原核表達
        3.1.7 多克隆抗體的制備
        3.1.8 ELISA間接法測定多克隆抗體效價
        3.1.9 Western blot檢測抗體特異性
            3.1.9.1 組織總蛋白的提取
            3.1.9.2 Western blot
        3.1.10 CyPB在肝臟組織中的定位
    3.2 實驗結(jié)果
        3.2.1 池蝶蚌不同組織中CyPA、B基因表達
        3.2.2 目的表達片段PCR擴增
        3.2.3 PCR產(chǎn)物回收
        3.2.4 重組質(zhì)粒雙酶切和鑒定
        3.2.5 目的蛋白的誘導(dǎo)表達
        3.2.6 融合蛋白可溶性分析
        3.2.7 蛋白純化
        3.2.8 Bradford法測定蛋白濃度
        3.2.9 多隆抗體效價
        3.2.10親環(huán)蛋白B抗體特異性分析
        3.2.11親環(huán)蛋白B在肝臟組織中的定位
    3.3 討論
第4章 CyPA、B對人肝癌細胞（HePG2）生長的影響
    4.1 實驗材料和方法
        4.1.1 實驗材料
        4.1.2 池蝶蚌親環(huán)蛋白A和親環(huán)蛋白B目的片段cDNA的克隆
            4.1.2.1 目的表達片段的引物設(shè)計
            4.1.2.2 PCR體系以及所需反應(yīng)的條件
            4.1.2.3 PCR擴增產(chǎn)物的檢測和PCR產(chǎn)物切膠回收純化
        4.1.3 池蝶蚌親環(huán)蛋白A和親環(huán)蛋白B真核表達載體的構(gòu)建
            4.1.3.1 目的片段與表達載體的鏈接
            4.1.3.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
            4.1.3.3 陽性重組質(zhì)粒的篩選
            4.1.3.4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定
        4.1.4 細胞培養(yǎng)
            4.1.4.1 細胞復(fù)蘇
            4.1.4.2 細胞培養(yǎng)及傳代
            4.1.4.3 細胞株的保藏
        4.1.5 細胞轉(zhuǎn)染
        4.1.6 激光共聚焦顯微鏡（LSCM)掃描帶GFP熒光的HePG2細胞
        4.1.7 流式細胞儀檢測帶GFP熒光HePG2細胞
    4.2 實驗結(jié)果
        4.2.1 目的片段PCR擴增
        4.2.2 陽性重組質(zhì)粒篩選和鑒定
        4.2.3 激光共聚焦顯微鏡（LSCM)檢測帶GFP熒光的HePG2細胞
        4.2.4 流式細胞儀（FCM）檢測帶GFP熒光的HePG2細胞
    4.3 討論
第5章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
致謝
攻讀碩士期間的研究成果
參考文獻



本文編號：3800867