遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中危害極大的革蘭氏陰性胞內(nèi)寄生菌。目前已發(fā)現(xiàn)六型分泌系統(tǒng)(T6SS)效應(yīng)子EvpP在其侵染過程中起重要作用。根據(jù)實驗室前期研究結(jié)果,遲鈍愛德華氏菌EIB202EvpP蛋白編碼基因evpP的GC含量較整個基因組來說偏低,暗示其為水平轉(zhuǎn)移獲得。組蛋白樣類核結(jié)構(gòu)蛋白H-NS廣泛存在于革蘭氏陰性菌中,是調(diào)控多種基因表達(dá)的全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。它可以特異性沉默通過水平基因轉(zhuǎn)移而來的異源基因。本課題旨在研究遲鈍愛德華氏菌H-NS對EvpP調(diào)控的分子機(jī)制。根據(jù)實驗室前期完成的E. tarda EIB202全基因組信息,發(fā)現(xiàn)其基因組中有兩個hns基因(ETAE₁505和ETAE₂968),這兩個hns基因所編碼的蛋白與大腸桿菌H-NS的同源度分別為81%和60%。本研究首先構(gòu)建hns突變株、過表達(dá)株及回補株并對各菌株的生長及致病力進(jìn)行考察,發(fā)現(xiàn)hns突變對E. tarda的生長狀態(tài)及對斑馬魚的半致死劑量均無明顯影響。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)H-NS對EvpP的轉(zhuǎn)錄具有抑制作用。在此基礎(chǔ)上,通過體外...

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 遲鈍愛德華氏菌
        1.1.1 遲鈍愛德華氏菌
        1.1.2 遲鈍愛德華氏菌的毒力調(diào)控網(wǎng)絡(luò)
        1.1.3 遲鈍愛德華氏菌T6SS效應(yīng)子EvpP
    1.2 組蛋白樣類核結(jié)構(gòu)蛋白H-NS
        1.2.1 類核蛋白H-NS的結(jié)構(gòu)與主要功能
        1.2.2 H-NS對DNA序列的識別
        1.2.3 H-NS沉默轉(zhuǎn)錄的作用機(jī)制
        1.2.4 H-NS與其它類核蛋白的相互作用
        1.2.5 H-NS異源基因沉默作用的解除途徑
    1.3 本論文的主要內(nèi)容和意義
第2章 hns突變株、回補株和過表達(dá)株構(gòu)建及表型分析
    2.1 前言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 菌種、質(zhì)粒、引物和培養(yǎng)基
        2.2.2 分析材料和軟件
        2.2.3 主要試劑及儀器設(shè)備
    2.3 實驗方法
        2.3.1 △1505和△2968框內(nèi)缺失突變株的構(gòu)建及篩選
        2.3.2 hns過表達(dá)菌株15050E和29680E及hns回補株2968⁺的構(gòu)建
        2.3.3 野生株E.tarda EIB202和hns各突變株生長曲線的測定
        2.3.4 半致死劑量(Lethy Dosage 50，LD₅0)的測定
    2.4 實驗結(jié)果
        2.4.1 hns基因分析
        2.4.2 插入失活突變株1505IM和框內(nèi)缺失突變株△2968的構(gòu)建
        2.4.3 hns過表達(dá)菌株1505OE和2968OE及,△2968的回補株2968⁺的構(gòu)建
        2.4.4 野生毒株E.tarda EIB202和hns各突變株及過表達(dá)株生長曲線的測定
        2.4.5 對模式動物斑馬魚的LD50

    2.5 討論
    2.6 本章小結(jié)
第3章 H-NS蛋白的異源表達(dá)及純化
    3.1 前言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 菌株、質(zhì)粒、引物和培養(yǎng)基
        3.2.2 分析材料及分析軟件
        3.2.3 主要試劑及儀器設(shè)備
    3.3 實驗方法
        3.3.1 H-NS蛋白異源表達(dá)株的構(gòu)建
        3.3.2 重組蛋白的異源可溶性誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.3 可溶性蛋白粗提物的制備
        3.3.4 SDS-PAGE 電泳
        3.3.5 Western blot分析
        3.3.6 H-NS蛋白的分離純化
        3.3.7 Bradford蛋白濃度定量法
    3.4 實驗結(jié)果
        3.4.1 H-NS-1505和H-NS-2968蛋白序列及結(jié)構(gòu)域分析
        3.4.2 H-NS蛋白異源表達(dá)株的構(gòu)建
        3.4.3 H-NS蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot鑒定
        3.4.4 H-NS蛋白的純化及鑒定
    3.5 討論
    3.6 本章小結(jié)
第4章 H-NS對T6SS效應(yīng)子EvpP的調(diào)控作用
    4.1 前言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 菌種、質(zhì)粒、引物和培養(yǎng)基
        4.2.2 分析材料及分析軟件
        4.2.3 主要試劑及儀器設(shè)備
    4.3 實驗方法
        4.3.1 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)
        4.3.2 evpP啟動子與ORF區(qū)域DNA片段的分區(qū)及擴(kuò)增
        4.3.3 電泳遷移率變動分析實驗(EMSA)
        4.3.4 DNase I footprinting實驗
        4.3.5 DNA彎曲度分析
    4.4 實驗結(jié)果
        4.4.1 E.tarda EIB202中evpP基因啟動子序列分析
        4.4.2 E.tarda EIB202中H-NS對evpP轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控
        4.4.3 EMSA實驗檢測H-NS與evpP基因區(qū)域的結(jié)合作用
        4.4.4 H-NS-1505與evpP結(jié)合位點序列分析
    4.5 討論
    4.6 本章小結(jié)
第5章 H-NS與EsrB對T6SS效應(yīng)子EvpP的共調(diào)控關(guān)系
    5.1 前言
    5.2 實驗材料
        5.2.1 菌種、質(zhì)粒、引物和培養(yǎng)基
        5.2.2 主要試劑及儀器設(shè)備
    5.3 實驗方法
        5.3.1 使用Octet Qke檢測分子相互作用
        5.3.2 細(xì)菌雙雜交實驗
    5.4 實驗結(jié)果
        5.4.1 EsrB蛋白異源表達(dá)株的構(gòu)建、誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
        5.4.2 Octet分子相互作用儀檢測H-NS與EsrB對evpP基因區(qū)域結(jié)合作用
        5.4.3 EMSA實驗檢測EsrB對evpP基因區(qū)域分區(qū)片段的結(jié)合情況
        5.4.4 細(xì)菌雙雜交實驗考察H-NS與EsrB的相互作用
    5.5 討論
    5.6 本章小結(jié)
第6章 結(jié)論與展望
    6.1 結(jié)論
    6.2 創(chuàng)新點
    6.3 展望
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間研究成果
致謝



本文編號：3763524

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