遲緩愛德華菌病是我國三類水生動物疫病,其病原遲緩愛德華菌具有廣泛的感染宿主,能夠感染魚類、爬行類、鳥類和哺乳類。尤其是感染魚類后,病魚會出現(xiàn)皮膚潰爛、器官壞死、全身性出血等癥狀,造成水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟損失。密度感應系統(tǒng)(Quorum sensing QS)是細菌種間重要的交流系統(tǒng),該系統(tǒng)信號分子是細菌進行種內和種間交流的通用語言。革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有著各自的密度感應系統(tǒng),同時還共同擁有一種唯一的密度感應系統(tǒng),即LuxS/AI-2密度感應系統(tǒng)。在該密度感應系統(tǒng)中,自體誘導物2(Autoinducer-2 AI-2)是信號分子。AI-2信號分子的合成酶Lux S是合成AI-2的關鍵因子,也是甲基循環(huán)的重要組成成分。LuxS不但能夠參與密度感應,還能夠影響誘導細菌生物發(fā)光、生物被膜的形成、群游現(xiàn)象等。本研究成功克隆到遲緩愛德華菌luxS基因,其長度為516bp,編碼172個氨基酸,預測其分子量大約為22kDa。對luxS基因序列進行分析得出,luxS基因高度保守,與多種細菌有著較高的同源性。我們應用同源重組方法成功構建了遲緩愛德華菌luxS基因缺失株,命名為△LuxS株,為后續(xù)研究...

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【學位級別】：碩士

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符號說明
中文摘要
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1 引言
    1.1 遲緩愛德華氏菌的研究進展
        1.1.1 遲緩愛德華菌的分類地位及生物學特性
        1.1.2 遲緩愛德華菌的流行情況與病害防治
        1.1.3 抗原性
        1.1.4 遲緩愛德華菌致病機理與毒力因子
    1.2 細菌密度感應的研究進展
        1.2.1 細菌密度感應系統(tǒng)
        1.2.2 密度感應系統(tǒng)的分類
            1.2.2.1 革蘭氏陰性菌的LuxI/LuxR信號系統(tǒng)
            1.2.2.2 革蘭氏陽性菌的密度感應系統(tǒng)
            1.2.2.3 LuxS/AI-2密度感應系統(tǒng)
        1.2.3 自體誘導物AI-2的合成
        1.2.4 密度感應抑制劑的研究
            1.2.4.1 信號分子類似物
            1.2.4.2 淬滅酶和酶抑制劑
            1.2.4.3 自誘導肽抑制劑
            1.2.4.4 其他密度感應抑制劑
    1.3 生物被膜的研究進展
        1.3.1 生物被膜的形成過程
        1.3.2 生物被膜的檢測方法
            1.3.2.1 生物被膜定性檢測法
            1.3.2.2 生物被膜定量檢測法
        1.3.3 生物被膜與群體感應關系
2 材料與方法
    2.1 材料
        2.1.1 主要菌株、質粒、細胞及試驗動物
            2.1.1.1 菌株
            2.1.1.2 質粒
            2.1.1.3 細胞
            2.1.1.4 試驗動物
        2.1.2 主要試劑及試劑盒
        2.1.3 主要實驗儀器
        2.1.4 培養(yǎng)基、抗生素貯存液及制備
            2.1.4.1 培養(yǎng)基
            2.1.4.2 抗生素貯存液
        2.1.5 常用溶液及緩沖液
    2.2 試驗方法
        2.2.1 遲緩愛德華菌的復蘇和鑒定
            2.2.1.1 遲緩愛德華菌株的純化
            2.2.1.2 遲緩愛德華菌的革蘭氏染色
            2.2.1.3 遲緩愛德華菌的16SrRNA
        2.2.2 遲緩愛德華菌EIB202株luxS基因的克隆及測序
            2.2.2.1 E.tEIB202基因組的提取
            2.2.2.2 E.tEIB202luxS基因PCR擴增及純化
            2.2.2.3 PCR純化產(chǎn)物和載體的連接與測序
        2.2.3 遲緩愛德華菌EIB202株luxS基因缺失株的構建
            2.2.3.1 SM10感受態(tài)細胞的制備
            2.2.3.2 缺失片段的構建
            2.2.3.3 克隆載體的構建
            2.2.3.4 接合載體的構建
            2.2.3.5 單交換菌株的篩選
            2.2.3.6 目的基因缺失株的篩選
        2.2.4 luxS基因的缺失對遲緩愛德華菌LuxS蛋白表達的影響
            2.2.4.1 樣品的準備
            2.2.4.2 SDS-PAGE
            2.2.4.3 WesternBlot檢測遲緩愛德華菌LuxS蛋白
        2.2.5 luxS基因的缺失對遲緩愛德華菌生長的影響
        2.2.6 luxS基因的缺失對遲緩愛德華菌致病性的影響
        2.2.7 luxS基因的缺失對遲緩愛德華菌黏蛋白穿透能力的影響
        2.2.8 luxS基因的缺失對AI-2的影響
        2.2.9 luxS基因的缺失對細菌生物被膜形成能力的影響
            2.2.9.1 結晶紫染色法
            2.2.9.2 激光共聚焦顯微鏡檢測法
        2.2.10 遲緩愛德華菌侵染鼠巨噬細胞試驗
            2.2.10.1 相對熒光定量檢測細菌侵染后細胞因子的變化
            2.2.10.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗法(ELISA)細菌侵染后細胞因子的檢測
        2.2.11 數(shù)據(jù)分析
3 試驗結果
    3.1 遲緩愛德華菌鑒定結果
    3.2 luxS基因的克隆與測序
    3.3 遲緩愛德華菌EIB202株luxS基因缺失株的構建
    3.4 LuxS蛋白的檢測
    3.5 遲緩愛德華菌EIB202株與△LuxS株生長曲線
    3.6 斑馬魚動物試驗結果
    3.7 黏蛋白穿透能力的檢測
    3.8 AI-2活性檢測
    3.9 生物被膜形成能力的檢測
        3.9.1 結晶紫染色法結果
        3.9.2 激光共聚焦顯微鏡觀察結果
    3.10 巨噬細胞侵染實驗結果
        3.10.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)結果
        3.10.2 實時熒光定量PCR結果
4 討論
5 結論
6 參考文獻
7 致謝
8 攻讀學位期間發(fā)表論文情況



本文編號：3759706