分離和篩選動物腸道芽孢桿菌,精準開發(fā)特異性的腸道益生菌,能夠更有效促進腸道認知,使其在動物腸道環(huán)境中迅速生長和形成菌落,維護腸道微生物區(qū)系與宿主平衡,大大提高飼料利用率,具有顯著的經(jīng)濟和生態(tài)效益。本研究從野生大黃魚腸道中分離、鑒定了一株芽孢桿菌,并對其培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,最后,探討了以不同食用菌菌糠為發(fā)酵底物的發(fā)酵培養(yǎng)腸道芽孢桿菌的可行性。具體研究結果如下:本文采用腸液梯度稀釋法,從健康的大黃魚腸道中,首先分離出一株芽孢桿菌LYC-1;結合菌落及顯微形態(tài)和基于16SrDNA的序列分析對其進行鑒定;利用水解圈的方法對該菌株產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶及超氧化物歧化酶(SOD)的定性分析;探討了該菌株對人工腸、胃液耐受性和滲透壓耐受性。結果顯示:該菌株與Bacillu(屬)簇集在一起,結合形態(tài)特征,確認LYC-1屬于芽孢桿菌屬。產(chǎn)酶分析顯示,該菌株具有蛋白酶、淀粉酶及SOD的分泌能力。而且,能夠耐受腸胃液及高濃度的滲透壓。采用單因素試驗研究了適合LYC-1產(chǎn)蛋白酶的碳氮源、無機鹽和發(fā)酵條件。用Placke-Burman試驗設計、.最陡爬坡試驗及響應面中的Box-Behnken法確定液...

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
中文文摘
第一章 緒論
    1.1 大黃魚的簡介
    1.2 微生物添加劑
        1.2.1 微生物添加劑的定義
        1.2.2 微生物添加劑的作用機理
            1.2.2.1 調整和保持微生態(tài)平衡理論
            1.2.2.2 微生物的奪氧理論
            1.2.2.3 生物拮抗理論
            1.2.2.4 微生物屏障理論
            1.2.2.5 增強機體免疫理論
            1.2.2.6 減少有害物質及促進營養(yǎng)物質合成理論
        1.2.3 微生物添加劑的應用
        1.2.4 微生物添加劑的分類
            1.2.4.1 光合細菌
            1.2.4.2 芽孢桿菌
            1.2.4.3 乳酸菌
            1.2.4.4 硝化細菌
            1.2.4.5 酵母菌
            1.2.4.6 蛭弧菌
            1.2.4.7 EM菌(Effective Microorganisms)
        1.2.5 微生物添加劑的發(fā)展狀況和發(fā)展趨勢
    1.3 食用菌菌糠
        1.3.1 食用菌菌糠的定義
        1.3.2 食用菌菌糠的營養(yǎng)價值
        1.3.3 食用菌菌糠的高效利用
        1.3.4 食用菌糠的發(fā)展前景
    1.4 本課題的選題依據(jù)以及研究內容
第二章 腸道芽孢桿菌的分離、鑒定及生物學特性的研究
    2.1 前言
    2.2 材料
        2.2.1 主要儀器
        2.2.2 主要試劑
        2.2.3 主要培養(yǎng)基與溶液配制
    2.3 方法
        2.3.1 樣品采集
        2.3.2 芽孢桿菌的分離
        2.3.3 芽孢桿菌菌懸液的制備
        2.3.4 美藍染色和革蘭氏染色
        2.3.5 芽孢桿菌的16S rDNA分子鑒定
            2.3.5.1 芽孢桿菌的基因組DNA提取
            2.3.5.2 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增16S rDNA
            2.3.5.3 1%瓊脂凝膠電泳
            2.3.5.4 目的DNA的連接與轉化
            2.3.5.5 菌落PCR驗證
            2.3.5.6 保種測序
        2.3.6 芽孢桿菌的生物學特性分析
            2.3.6.1 產(chǎn)酶酶活的初篩測定——水解圈法
            2.3.6.2 SOD酶活的測定——鄰苯三酚自氧化法
            2.3.6.3 人工腸液耐受性測定
            2.3.6.4 人工胃液耐受性測定
            2.3.6.5 滲透壓耐受性測定
    2.4 結果與分析
        2.4.1 芽孢桿菌的分離
        2.4.2 美藍染色和革蘭氏染色
        2.4.3 芽孢桿菌的16S rDNA分子鑒定
            2.4.3.1 基因組DNA提取
            2.4.3.2 聚合酶鏈式反應(PCR)擴增16S rDNA
            2.4.3.3 割膠回收及擴增產(chǎn)物的純化
            2.4.3.4 菌落PCR驗證
            2.4.3.5 16S rDNA基因序列測序結果與進化樹的構建分析
        2.4.4 LYC-1的生物學特性分析
            2.4.4.1 蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶的產(chǎn)酶特性
            2.4.4.2 SOD酶的產(chǎn)酶特性
            2.4.4.3 LYC-1菌株人工腸液耐受性研究
            2.4.4.4 LYC-1菌株人工胃液耐受性研究
            2.4.4.5 LYC-1菌株滲透壓耐受性研究
    2.5 小結
第三章 芽孢桿菌LYC-1菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的研究
    3.1 前言
    3.2 材料
        3.2.1 菌種
        3.2.2 主要儀器
        3.2.3 主要試劑和溶液配制
    3.3 方法
        3.3.1 蛋白酶標準曲線的測定
        3.3.2 樣液蛋白酶的測定
        3.3.3 樣液的制備
        3.3.4 LYC-1菌株搖瓶發(fā)酵
            3.3.4.1 碳源對LYC-1產(chǎn)蛋白酶活的影響
            3.3.4.2 氮源對LYC-1產(chǎn)蛋白酶活的影響
            3.3.4.3 無機鹽對LYC-1產(chǎn)蛋白酶活的影響
            3.3.4.4 發(fā)酵條件對LYC-1產(chǎn)蛋白酶的影響
            3.3.4.5 Placke-Burman設計篩選主要影響因素
            3.3.4.6 最陡爬坡試驗
            3.3.4.7 Box-Behnken實驗設計優(yōu)化
        3.3.5 LYC-1菌株發(fā)酵罐發(fā)酵研究
    3.4 結果與分析
        3.4.1 蛋白酶標準曲線
        3.4.2 LYC-1菌株搖瓶發(fā)酵
            3.4.2.1 液體基質的篩選
                3.4.2.1.1 碳源對LYC-1產(chǎn)蛋白酶活的影響
                3.4.2.1.2 最適碳源濃度的確定
                3.4.2.1.3 氮源對LYC-1產(chǎn)蛋白酶活的影響
                3.4.2.1.4 最適氮源濃度的確定
                3.4.2.1.5 無機鹽對LYC-1產(chǎn)蛋白酶活的影響
            3.4.2.2 發(fā)酵條件對LYC-1產(chǎn)蛋白酶的影響
                3.4.2.2.1 初始pH的優(yōu)化
                3.4.2.2.2 發(fā)酵溫度的優(yōu)化
                3.4.2.2.3 轉速的優(yōu)化
                3.4.2.2.4 搖瓶裝液量的優(yōu)化
            3.4.2.3 Placke-Burman設計篩選主要影響因素
            3.4.2.4 最陡爬坡試驗
            3.4.2.5 Box-Behnken實驗設計優(yōu)化
            3.4.2.6 模型驗證實驗
        3.4.3 發(fā)酵罐發(fā)酵周期對蛋白酶活的影響
    3.5 小結
第四章 芽孢桿菌LYC-1菌株菌糠發(fā)酵制備飼料添加劑的研究
    4.1 前言
    4.2 材料
        4.2.1 菌種和菌糠
        4.2.2 主要試劑和培養(yǎng)基配制
        4.2.3 主要儀器
    4.3 方法
        4.3.1 菌糠的處理方法
        4.3.2 檢測芽孢數(shù)的方法
        4.3.3 種子液的制備
        4.3.4 接種與培養(yǎng)
        4.3.5 基礎培養(yǎng)基的確定
        4.3.6 單因素試驗
            4.3.6.1 玉米粉不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響
            4.3.6.2 豆粕粉不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響
            4.3.6.3 麩皮不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響
            4.3.6.4 磷酸二氫鉀不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響
            4.3.6.5 碳酸鈣不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響
        4.3.7 菌糠固體發(fā)酵正交試驗
    4.4 結果與分析
        4.4.1 三種菌糠發(fā)酵的結果與分析
        4.4.2 單因素實驗
            4.4.2.1 玉米粉不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響
            4.4.2.2 豆粕粉不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響
            4.4.2.3 麩皮不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響
            4.4.2.4 磷酸二氫鉀不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響
            4.4.2.5 碳酸鈣不同添加量對LYC-1芽孢數(shù)的影響
        4.4.3 金針菇菌糠發(fā)酵培養(yǎng)基的正交試驗研究
    4.5 小結
第五章 總結與展望
    5.1 總結
        5.1.1 腸道芽孢桿菌的分離、鑒定及生物學特性的研究
        5.1.2 芽孢桿菌LYC-1菌株液體發(fā)酵工藝
        5.1.3 芽孢桿菌LYC-1菌糠發(fā)酵培養(yǎng)的研究
    5.2 展望
參考文獻
攻讀學位期間承擔的科研任務與主要成果
致謝
個人簡歷



本文編號：3738571