持留菌是一小部分表型異質(zhì)性變異體,能在高濃度抗生素中瞬時(shí)存活,引起人類和水生動物的反復(fù)感染。維氏氣單胞菌(A.veronii)是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最具威脅的病原體之一,它在水產(chǎn)養(yǎng)殖中引起大量死亡,給養(yǎng)魚業(yè)造成災(zāi)難性的經(jīng)濟(jì)損失,并且對多種抗生素表現(xiàn)出天然抗藥性。轉(zhuǎn)移-信使RNA(tmRNA)由ssr A基因編碼,是反式翻譯的元件之一,并被鑒定為介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類抗生素持留性的決定性調(diào)節(jié)因子。N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)是細(xì)菌肽聚糖的組成成分之一,主要參與氨基糖核苷糖代謝,在細(xì)菌的致病性方面發(fā)揮作用。本研究以維氏氣單胞菌C4 tmRNA為研究對象,檢測野生型和tmRNA缺失株的生長曲線情況,發(fā)現(xiàn)兩者生長曲線之間沒有差異性,說明在維氏氣單胞菌中tmRNA對生長不是必須的。接著,檢測野生型和tmRNA缺失株的頭孢噻肟持留菌的形成,發(fā)現(xiàn)tmRNA缺失株的持留菌顯著增加。為了進(jìn)一步探究該差異產(chǎn)生的原因,通過添加氯霉素預(yù)處理,模擬蛋白質(zhì)合成受阻的條件,發(fā)現(xiàn)野生型中持留菌顯著增加,tmRNA缺失株持留菌也略微增加,其原因可能與蛋白質(zhì)合成減少有關(guān)。然后,通過分析轉(zhuǎn)錄學(xué)和代謝組學(xué)分析表型變化的分子基礎(chǔ),結(jié)果表明t...

【文章頁數(shù)】：78 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 導(dǎo)論
    1.1 tmRNA簡介
        1.1.1 tmRNA的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2 tmRNA的結(jié)構(gòu)
        1.1.3 tmRNA的生物學(xué)功能
    1.2 持留菌研究進(jìn)展
        1.2.1 持留菌的發(fā)現(xiàn)
        1.2.2 持留菌形成機(jī)制
    1.3 GlcNAc的研究進(jìn)展
    1.4 研究內(nèi)容、目的及意義
    1.5 技術(shù)路線
2 材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 菌株和質(zhì)粒
        2.1.2 本實(shí)驗(yàn)所用引物
        2.1.3 本試驗(yàn)主要試劑及試劑盒
        2.1.4 培養(yǎng)基及實(shí)驗(yàn)室常用試劑配方
        2.1.5 主要的儀器和設(shè)備
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 菌種的活化與保藏
        2.2.2 基因組和質(zhì)粒的提取
        2.2.3 PCR擴(kuò)增條件和體系
        2.2.4 DNA片段回收
        2.2.5 限制性內(nèi)切酶酶切體系及方法
        2.2.6 T4 DNA Ligase連接反應(yīng)體系及方法
        2.2.7 大腸桿菌電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備
        2.2.8 大腸桿菌的電擊轉(zhuǎn)化
        2.2.9 重組子的篩選與鑒定
        2.2.10 雙親接合
        2.2.11 nagE基因缺失菌株篩選
        2.2.12 RNA提取
        2.2.13 實(shí)時(shí)定量PCR
        2.2.14 生長曲線的測定
        2.2.15 MIC/MBC測定
        2.2.16 藥敏曲線的測定
        2.2.17 RNA測序和生物信息學(xué)分析
        2.2.18 代謝組學(xué)分析
        2.2.19 GlcNAc相對含量的測定
        2.2.20 NaCl滲透脅迫的耐受性測定
        2.2.21 統(tǒng)計(jì)分析
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析
    3.1 tmRNA缺乏增加頭孢噻肟作用下的持留菌形成
        3.1.1 野生型和tmRNA缺失株生長曲線測定
        3.1.2 野生型和tmRNA缺失株持留菌形成測定
    3.2 tmRNA缺失導(dǎo)致代謝產(chǎn)物GlcNAc的積累
        3.2.1 野生型和tmRNA缺失株的轉(zhuǎn)錄組分析
        3.2.2 野生型和tmRNA缺失株的代謝組分析
        3.2.3 GlcNAc下游肽聚糖合成途徑相關(guān)基因分析
        3.2.4 tmRNA缺失株影響GlcNAc下游肽聚糖合成通路
    3.3 外源添加GlcNAc引起維氏氣單胞菌相關(guān)表型變化
        3.3.1 生長曲線測定
        3.3.2 NaCl脅迫耐受性測定
        3.3.3 藥敏曲線測定
    3.4 nagE缺失株引起維氏氣單胞菌相關(guān)表型變化
        3.4.1 nagE缺失株的構(gòu)建
        3.4.2 野生型和nagE缺失株的生長曲線檢測
        3.4.3 野生型和nag E缺失株的Na Cl滲透脅迫耐受性檢測
        3.4.4 野生型和nagE缺失株的藥敏曲線測定
4 討論
    4.1 tmRNA對頭孢噻肟持留菌形成的影響
    4.2 GlcNAc對維氏氣單胞菌C4 相關(guān)表型的影響
        4.2.1 tmRNA缺失株引起胞間代謝物GlcNAc累積
        4.2.2 GlcNAc引起維氏氣單胞菌C4 相關(guān)表型變化
5 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
縮略語表
附錄
基金項(xiàng)目資助
攻讀碩士期間發(fā)表的文章
致謝



本文編號：3737777