弧菌（Vibrio）種類繁多,廣泛分布于自然界中,特別是在水生動物及水體中比較常見。其中霍亂弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌和溶藻弧菌是較常見的致病性弧菌,不僅對動物有致病性,還嚴重威脅著人類健康。針對這5種弧菌,建立敏感快速的檢測方法非常必要。副溶血弧菌是引起食源性細菌胃腸炎的最主要原因,主要的毒力因子是耐熱直接溶血素（TDH）和耐熱相關(guān)溶血素（TRH）。根據(jù)副溶血弧菌的兩種毒力因子tdh、trh和種特異性基因toxR,分別設(shè)計1對特異性的引物及相應(yīng)的TaqMan探針,應(yīng)用于熒光定量PCR反應(yīng)。通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù),建立單重和三重熒光定量PCR,用于快速準確檢測副溶血弧菌。研究表明,建立的方法擴增效率均在95%-110%之間;特異性試驗表明,只有副溶血弧菌擴增明顯,對其它細菌無擴增,表明該方法良好的特異性;單重反應(yīng)靈敏度比常規(guī)PCR高出100倍,多重反應(yīng)布菌檢測靈敏度均在103CFU/g左右,表明該法敏感性強;重復3次試驗,每組變異系數(shù)均小于1.8%,表明該方法重復性好。以霍亂弧菌的種特異性基因外膜蛋白W基因（ompW）和毒力因子霍亂毒素基因（ctx）、溶血素（hly）為靶... 

【文章頁數(shù)】：89 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一篇 文獻綜述
    第一章 弧菌及其毒力因子研究進展
        1 副溶血弧菌
            1.1 溶血素
                1.1.1 耐熱直接溶血素
                1.1.2 耐熱相關(guān)溶血素
                1.1.3 不耐熱溶血素
            1.2 Ⅲ型分泌系統(tǒng)
            1.3 尿素酶
            1.4 黏附相關(guān)因子
            1.5 其他毒力因子
        2 霍亂弧菌
            2.1 霍亂毒素
            2.2 毒素協(xié)同菌毛
            2.3 凝血素
        3 創(chuàng)傷弧菌
            3.1 創(chuàng)傷弧菌溶細胞素
            3.2 金屬蛋白酶
            3.3 其他毒力因子
        4 擬態(tài)弧菌
            4.1 溶血素
            4.2 黏附素
            4.3 外毒素
        5 溶藻弧菌
            5.1 膠原蛋白酶
            5.2 堿性絲氨酸蛋白酶
            5.3 鐵攝取調(diào)控系統(tǒng)
    第二章 弧菌的檢測方法進展
        1 傳統(tǒng)的檢測鑒定方法
        2 免疫學方法
            2.1 酶聯(lián)免疫吸附
            2.2 免疫膠體金層析技術(shù)
            2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)
            2.4 免疫熒光技術(shù)
        3 基因芯片技術(shù)
        4 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)
            4.1 常規(guī)PCR技術(shù)
            4.2 多重PCR法
            4.3 環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)
            4.4 實時熒光定量PCR技術(shù)
        5 小結(jié)
第二篇 試驗研究
    第三章 副溶血弧菌多重熒光定量PCR檢測方法的建立
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 菌種
                1.1.2 主要試劑
                1.1.3 主要儀器
            1.2 方法
                1.2.1 引物及探針的設(shè)計與合成
                1.2.2 DNA的提取
                1.2.3 三重實時熒光定量PCR陽性標準品的制備
                1.2.4 副溶血弧菌單重熒光定量PCR方法的建立
                1.2.5 副溶血弧菌三重熒光定量PCR檢測方法的建立
                1.2.6 樣品的檢測
        2 結(jié)果與分析
            2.1 目的片段的PCR擴增
            2.2 重組質(zhì)粒PCR鑒定
            2.3 重組質(zhì)粒制備及濃度測定
            2.4 副溶血弧菌單重熒光定量PCR方法的建立
                2.4.1 單重熒光定量PCR標準曲線
                2.4.2 單重熒光定量PCR特異性
                2.4.3 單重熒光定量PCR敏感性
            2.5 副溶血弧菌三重熒光定量PCR檢測方法的建立
                2.5.1 三重熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件
                2.5.2 三重熒光定量PCR標準曲線
                2.5.3 三重熒光定量PCR的特異性
                2.5.4 三重熒光定量PCR的靈敏度
                2.5.5 三重熒光定量PCR的重復性
            2.6 樣品檢測
        3 討論
    第四章 霍亂弧菌多重熒光定量PCR檢測方法建立
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 菌種
                1.1.2 主要試劑
                1.1.3 主要儀器
            1.2 方法
                1.2.1 引物及探針的設(shè)計與合成
                1.2.2 基因組的提取
                1.2.3 三重實時熒光定量PCR陽性標準品的制備
                1.2.4 霍亂弧菌單重熒光定量PCR方法建立
                1.2.5 霍亂弧菌三重實時熒光定量PCR檢測方法的建立
                1.2.6 樣品檢測
        2 結(jié)果與分析
            2.1 目的片段的PCR擴增
            2.2 重組質(zhì)粒PCR鑒定
            2.3 重組質(zhì)粒制備及濃度測定
            2.4 霍亂弧菌單重熒光定量PCR方法的建立
                2.4.1 單重熒光定量PCR標準曲線
                2.4.2 單重熒光定量PCR特異性
                2.4.3 單重熒光定量PCR敏感性
            2.5 霍亂弧菌三重熒光定量PCR檢測方法的建立
                2.5.1 三重熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件
                2.5.2 三重熒光定量PCR標準曲線
                2.5.3 三重熒光定量PCR特異性
                2.5.4 三重熒光定量PCR敏感性
                2.5.5 霍亂弧菌三重熒光定量PCR重復性檢測
            2.6 樣品檢測
        3 討論
    第五章 創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌和溶藻弧菌多重熒光定量PCR檢測方法的建立
        1 材料與方法
            1.1 材料
                1.1.1 菌種
                1.1.2 主要試劑
                1.1.3 主要儀器
            1.2 方法
                1.2.1 引物及探針的設(shè)計與合成
                1.2.2 基因組的提取
                1.2.3 三重實時熒光定量PCR陽性標準品的制備
                1.2.4 創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌及溶藻弧菌單重熒光定量PCR方法的建立
                1.2.5 創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌和溶藻弧菌三重熒光定量PCR方法的建立
                1.2.6 樣品檢測
        2 結(jié)果與分析
            2.1 目的片段的PCR擴增
            2.2 重組質(zhì)粒PCR鑒定
            2.3 重組質(zhì)粒制備及濃度測定
            2.4 創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌及溶藻弧菌單重熒光定量PCR方法的建立
                2.4.1 單重熒光定量PCR標準曲線
                2.4.2 單重熒光定量PCR敏感性
                2.4.3 單重熒光定量PCR特異性
            2.5 創(chuàng)傷弧菌、擬態(tài)弧菌和溶藻弧菌三重熒光定量PCR檢測方法的建立
                2.5.1 三重熒光定量PCR反應(yīng)體系及條件的確定
                2.5.2 三重熒光定量PCR標準曲線
                2.5.3 三重實時熒光定量PCR特異性
                2.5.4 三重實時熒光定量PCR敏感性的檢測
                2.5.5 三重實時熒光定量PCR重復性
            2.6 樣品檢測
        3 討論
參考文獻
全文總結(jié)
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3723011