牙鲆（Paralichthys olivaceus）作為珍貴的溫帶海洋性物種之一,由于其蛋白質(zhì)含量較高,個體大,脂滿味美且極易消化,具有很高的營養(yǎng)和經(jīng)濟價值,已經(jīng)成為我國重要的海洋魚類養(yǎng)殖品種。人工養(yǎng)殖中,雌魚2年齡性腺發(fā)育成熟,雄魚1年齡性腺就已發(fā)育完成,但鑒于雄魚用于精巢發(fā)育所消耗的能量要比同時期還未性成熟的雌魚多的多,加之性成熟后牙鲆雄魚有近5個月的繁殖期,攝取的營養(yǎng)大多用于繁殖,在人工培育過程中雌魚個體要明顯大于雄魚,所以通過性別控制來增加養(yǎng)殖產(chǎn)量成為重要的研究內(nèi)容。因而相關的性別決定及性腺發(fā)育分子機制的研究也備受重視。牙鲆中已有不少關于性腺發(fā)育和分化相關基因的鑒定和功能分析報道,但此類基因的挖掘多集中于這些編碼基因的表達規(guī)律和功能分析,對其轉錄后水平調(diào)控尤其是micro RNA（mi RNA）的研究鮮有報道。本實驗室先前已建立了牙鲆精卵巢mi RNA文庫,并通過第二代測序（NGS）技術和生物信息學方法鑒定了141個成熟mi RNA,篩選出一批在牙鲆雌雄性腺中差異或特異表達的mi RNA。在此基礎上,本研究首先挑選了2個表達量較高且在精卵巢中顯著差異表達的mi RNA（pol-... 

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
引言
    1 魚類性別決定和性腺分化
    2 牙鲆性腺分化及性別決定
    3 microRNA簡介
    4 研究目的和意義
第一章 pol-miR-26a, 26b在牙鲆性腺中的表達分析
    1 實驗材料
        1.1 實驗用魚
        1.2 實驗試劑
        1.3 溶液配制
        1.4 實驗儀器
    2 實驗方法
        2.1 總RNA提取與鑒定
        2.2 實時熒光定量qRT-PCR分析pol-miR-26a, 26b的組織表達
        2.3 原位雜交技術分析pol-mi R-26a, 26b的定位表達
    3 結果
        3.1 總RNA提取質(zhì)量檢測
        3.2 牙鲆pol-miR-26a, 26b在不同組織中的定量表達
        3.3 牙鲆pol-miR-26a, 26b在牙鲆精巢、卵巢和腦組織中的定位表達
    4 討論
第二章 牙鲆emx2 基因的克隆和定量表達分析
    1 實驗材料
        1.1 實驗用魚
        1.2 實驗試劑
        1.3 溶液配制
    2 實驗方法
        2.1 總RNA提取與鑒定
        2.2 牙鲆emx2 基因的cDNA片段克隆
        2.3 牙鲆emx2 基因的 3’UTR片段的克隆
        2.4 牙鲆emx2 基因的編碼區(qū)和 3’UTR片段的拼接
        2.5 序列分析
        2.6 實時熒光定量qRT-PCR分析emx2 的表達
    3 結果
        3.1 總RNA提取質(zhì)量檢測
        3.2 牙鲆emx2 cDNA小片段及 3’UTR的克隆
        3.3 牙鲆emx2 序列比對及進化樹建立
        3.4 牙鲆emx2 基因在不同組織和不同發(fā)育時期的表達
    4 討論
第三章 雙熒光素酶報告載體的構建及miRNA靶基因驗證
    1 實驗材料
        1.1 細胞系
        1.2 實驗試劑
        1.3 實驗儀器
    2 實驗方法
        2.1 試劑配制
        2.2 293T細胞培養(yǎng)
        2.3 miRNA靶點預測
        2.4 牙鲆總RNA提取與鑒定
        2.5 DNase I處理剛提總RNA
        2.6 雙熒光素酶報告野生載體的構建
        2.7 雙熒光素酶報告突變載體的構建
        2.8 雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測結合位點
    3 結果
        3.1 miRNA靶點預測結果
        3.2 總RNA提取質(zhì)量檢測
        3.3 靶標 3’-UTR區(qū)克隆結果
        3.4 定點誘變結果
        3.5 野生型和突變型重組報告載體的鑒定
        3.6 雙熒光素酶報告檢測結果
    4 討論
結語
參考文獻
附錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[2]魚類生殖發(fā)育調(diào)控研究進展[J]. 陳戟,胡煒,朱作言.  科學通報. 2013(02)
[3]檢測miRNA活性的雙熒光素酶單載體[J]. 畢延震,鄭新民,邵長偉,潘雯,姜黎,歐陽輝武,喬憲鳳,劉西梅.  中國生物化學與分子生物學報. 2012(08)
[4]水產(chǎn)動物重要經(jīng)濟性狀的分子基礎及其遺傳改良[J]. 桂建芳,朱作言.  科學通報. 2012(19)
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[8]大鱗副泥鰍ZZ/ZW型性別決定的細胞遺傳學證據(jù)[J]. 常重杰,余其興.  遺傳. 1997(03)
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碩士論文
[1]牙鲆Paralichthys olivaceus性腺分化與發(fā)育的組織學研究[D]. 孫朝徽.東北農(nóng)業(yè)大學 2008



本文編號：3698660