Collagen Ⅵ（COLⅥ）是膠原蛋白家族的重要成員,廣泛分布于動物體細胞外基質,在脊椎動物骨骼形成過程發(fā)揮重要作用。根據(jù)本課題組前期建立的馬氏珠母貝貝殼基質蛋白數(shù)據(jù)庫,篩選出六個在貝殼含量較高的COLⅥ蛋白。為了探究COLⅥ在馬氏珠母貝貝殼形成中的作用,本實驗運用聚合酶鏈式反應（PCR）和cDNA末端快速擴增技術（RACE）獲得COLⅥ基因的cDNA全長,利用熒光定量PCR技術檢測基因的表達量分布,并采用原位雜交技術對COLⅥ進行精確定位。通過RNAi技術促使基因表達沉默,探究COLⅥ對貝殼結晶的影響。并利用原核表達技術獲得了Pm COLⅥA4-1的重組蛋白。1.本實驗成功克隆得到COLⅥ基因Pm COLⅥA4-1、Pm COLⅥA6-1、Pm COLⅥA6-2的cDNA全長。Pm COLⅥA4-1序列全長3136bp,其中開放閱讀框（ORF）長2841bp,編碼946個氨基酸,5’非翻譯區(qū)（5’UTR）長93bp,3’非翻譯區(qū)（3’UTR）長202bp。Pm COLⅥA6-1序列全長2100bp,其中開放閱讀框（ORF）長1875bp,編碼624個氨基酸,5’非翻譯區(qū)（5’UT... 

【文章頁數(shù)】：108 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻綜述
    1.1 生物礦化
    1.2 軟體動物貝殼基質蛋白
        1.2.1 珍珠層特有基質蛋白
        1.2.2 棱柱層特有基質蛋白
        1.2.3 珍珠層和棱柱層共有基質蛋白
    1.3 膠原蛋白
        1.3.1 纖維膠原
        1.3.2 FACITs
        1.3.3 網(wǎng)狀膠原蛋白
        1.3.4 跨膜膠原蛋白
        1.3.5 血管內(nèi)皮抑制素前體膠原蛋白
        1.3.6 其他膠原蛋白
    1.4 參與礦化的膠原蛋白
    1.5 COLⅥ基因的研究意義
2 馬氏珠母貝COLⅥ基因的克隆和生物學信息分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實驗材料
            2.1.1.1 實驗動物
            2.1.1.2 實驗試劑
            2.1.1.3 實驗儀器
            2.1.1.4 引物
        2.1.2 實驗方法
            2.1.2.1 總RNA的提取
            2.1.2.2 cDNA第一鏈的合成
            2.1.2.3 基因片段的克隆
            2.1.2.4 基因的非編碼區(qū)克隆（RACE）
            2.1.2.5 5’調控區(qū)的克隆
    2.2 實驗結果
        2.2.1 目標基因的篩選
        2.2.2 馬氏珠母貝COLⅥ基因的克隆
            2.2.2.1 PmCOLⅥA3基因的克隆
            2.2.2.2 PmCOLⅥA4基因的克隆
            2.2.2.3 PmCOLⅥA5基因的克隆
            2.2.2.4 PmCOLⅥA6基因的克隆
            2.2.2.5 PmCOLⅥA6-1 的基因結構和 5’調控區(qū)克隆
        2.2.3 馬氏珠母貝COLⅥs的生物學信息分析
            2.2.3.1 PmCOLⅥA3的氨基酸序列特征
            2.2.3.2 PmCOLⅥA4的氨基酸序列特征
            2.2.3.3 PmCOLⅥA5的氨基酸序列特征
            2.2.3.4 PmCOLⅥ6A的氨基酸序列特征
            2.2.3.5 馬氏珠母貝COLⅥ蛋白的結構域分析
            2.2.3.6 馬氏珠母貝COLⅥ蛋白的空間結構預測
            2.2.3.7 馬氏珠母貝COLⅥ的多序列比對
    2.3 討論
3 COLⅥ在馬氏珠母貝不同組織的表達模式和精細定位
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實驗材料
            3.1.1.1 實驗動物
            3.1.1.2 實驗試劑
            3.1.1.3 實驗儀器
            3.1.1.4 引物
        3.1.2 實驗方法
            3.1.2.1 熒光定量PCR實驗
            3.1.2.2 原位雜交實驗
    3.2 實驗結果
        3.2.1 COLⅥ在馬氏珠母貝中的表達模式
        3.2.2 COLⅥ在馬氏珠母貝外套膜的定位
    3.3 討論
4 馬氏珠母貝COLⅥ的功能研究
    4.1 實驗材料與方法
        4.1.1 實驗材料
            4.1.1.1 實驗動物
            4.1.1.2 實驗試劑
            4.1.1.3 實驗儀器
            4.1.1.4 引物
        4.1.2 實驗方法
            4.1.2.1 雙鏈RNAi探針的制備
            4.1.2.2 RNAi探針的注射
            4.1.2.3 RNAi實驗效果的檢測
    4.2 實驗結果
        4.2.1 RNAi探針的制備
        4.2.2 熒光定量PCR檢測RNAi探針的沉默效果
        4.2.3 COLⅥ基因沉默后的貝殼超微結構的變化
    4.3 討論
5 PmCOLⅥA4重組蛋白的表達
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實驗材料
            5.1.1.1 實驗試劑
            5.1.1.2 實驗儀器
        5.1.2 實驗方法
            5.1.2.1 pET30- PmCOLⅥA4重組載體的構建
            5.1.2.2 PmCOLⅥA4重組蛋白的誘導表達
            5.1.2.3 PmCOLⅥA4重組蛋白的純化
    5.2 實驗結果
        5.2.1 pET30a- PmCOLⅥA4-1 重組質粒的構建
        5.2.2 PmCOLⅥA4-1 蛋白的誘導表達
        5.2.3 PmCOLⅥA4-1 蛋白的擴大培養(yǎng)
        5.2.4 PmCOLⅥA4-1 蛋白的純化
        5.2.5 Western blotting檢測
    5.3 討論
6 結論
參考文獻
附錄
致謝
作者簡介
導師簡介


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Matrilin家族的研究進展[J]. 麥俊妮,陳嬋嬋,凌均棨.  國際口腔醫(yī)學雜志. 2009(06)
[2]X型膠原蛋白與骨骼生長發(fā)育關系的研究進展[J]. 鄭謙,張筱薇.  國外醫(yī)學.口腔醫(yī)學分冊. 2002(02)

博士論文
[1]ACCBP對無定形碳酸鈣形成與轉化調控機制的研究[D]. 蘇境坦.清華大學 2013

碩士論文
[1]馬氏珠母貝珍珠層基質蛋白基因的克隆與功能研究[D]. 董冰冰.廣東海洋大學 2015
[2]大珠母貝金屬硫蛋白cDNA序列克隆與表達研究[D]. 唐仁生.華中農(nóng)業(yè)大學 2009



本文編號：3674524