發(fā)布時間：2022-08-11 10:52

　　Collagen Ⅵ（COLⅥ）是膠原蛋白家族的重要成員,廣泛分布于動物體細(xì)胞外基質(zhì),在脊椎動物骨骼形成過程發(fā)揮重要作用。根據(jù)本課題組前期建立的馬氏珠母貝貝殼基質(zhì)蛋白數(shù)據(jù)庫,篩選出六個在貝殼含量較高的COLⅥ蛋白。為了探究COLⅥ在馬氏珠母貝貝殼形成中的作用,本實驗運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（RACE）獲得COLⅥ基因的cDNA全長,利用熒光定量PCR技術(shù)檢測基因的表達(dá)量分布,并采用原位雜交技術(shù)對COLⅥ進(jìn)行精確定位。通過RNAi技術(shù)促使基因表達(dá)沉默,探究COLⅥ對貝殼結(jié)晶的影響。并利用原核表達(dá)技術(shù)獲得了Pm COLⅥA4-1的重組蛋白。1.本實驗成功克隆得到COLⅥ基因Pm COLⅥA4-1、Pm COLⅥA6-1、Pm COLⅥA6-2的cDNA全長。Pm COLⅥA4-1序列全長3136bp,其中開放閱讀框（ORF）長2841bp,編碼946個氨基酸,5’非翻譯區(qū)（5’UTR）長93bp,3’非翻譯區(qū)（3’UTR）長202bp。Pm COLⅥA6-1序列全長2100bp,其中開放閱讀框（ORF）長1875bp,編碼624個氨基酸,5’非翻譯區(qū)（5’UT... 

【文章頁數(shù)】：108 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 生物礦化
    1.2 軟體動物貝殼基質(zhì)蛋白
        1.2.1 珍珠層特有基質(zhì)蛋白
        1.2.2 棱柱層特有基質(zhì)蛋白
        1.2.3 珍珠層和棱柱層共有基質(zhì)蛋白
    1.3 膠原蛋白
        1.3.1 纖維膠原
        1.3.2 FACITs
        1.3.3 網(wǎng)狀膠原蛋白
        1.3.4 跨膜膠原蛋白
        1.3.5 血管內(nèi)皮抑制素前體膠原蛋白
        1.3.6 其他膠原蛋白
    1.4 參與礦化的膠原蛋白
    1.5 COLⅥ基因的研究意義
2 馬氏珠母貝COLⅥ基因的克隆和生物學(xué)信息分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 實驗材料
            2.1.1.1 實驗動物
            2.1.1.2 實驗試劑
            2.1.1.3 實驗儀器
            2.1.1.4 引物
        2.1.2 實驗方法
            2.1.2.1 總RNA的提取
            2.1.2.2 cDNA第一鏈的合成
            2.1.2.3 基因片段的克隆
            2.1.2.4 基因的非編碼區(qū)克�。≧ACE）
            2.1.2.5 5’調(diào)控區(qū)的克隆
    2.2 實驗結(jié)果
        2.2.1 目標(biāo)基因的篩選
        2.2.2 馬氏珠母貝COLⅥ基因的克隆
            2.2.2.1 PmCOLⅥA3基因的克隆
            2.2.2.2 PmCOLⅥA4基因的克隆
            2.2.2.3 PmCOLⅥA5基因的克隆
            2.2.2.4 PmCOLⅥA6基因的克隆
            2.2.2.5 PmCOLⅥA6-1 的基因結(jié)構(gòu)和 5’調(diào)控區(qū)克隆
        2.2.3 馬氏珠母貝COLⅥs的生物學(xué)信息分析
            2.2.3.1 PmCOLⅥA3的氨基酸序列特征
            2.2.3.2 PmCOLⅥA4的氨基酸序列特征
            2.2.3.3 PmCOLⅥA5的氨基酸序列特征
            2.2.3.4 PmCOLⅥ6A的氨基酸序列特征
            2.2.3.5 馬氏珠母貝COLⅥ蛋白的結(jié)構(gòu)域分析
            2.2.3.6 馬氏珠母貝COLⅥ蛋白的空間結(jié)構(gòu)預(yù)測
            2.2.3.7 馬氏珠母貝COLⅥ的多序列比對
    2.3 討論
3 COLⅥ在馬氏珠母貝不同組織的表達(dá)模式和精細(xì)定位
    3.1 材料與方法
        3.1.1 實驗材料
            3.1.1.1 實驗動物
            3.1.1.2 實驗試劑
            3.1.1.3 實驗儀器
            3.1.1.4 引物
        3.1.2 實驗方法
            3.1.2.1 熒光定量PCR實驗
            3.1.2.2 原位雜交實驗
    3.2 實驗結(jié)果
        3.2.1 COLⅥ在馬氏珠母貝中的表達(dá)模式
        3.2.2 COLⅥ在馬氏珠母貝外套膜的定位
    3.3 討論
4 馬氏珠母貝COLⅥ的功能研究
    4.1 實驗材料與方法
        4.1.1 實驗材料
            4.1.1.1 實驗動物
            4.1.1.2 實驗試劑
            4.1.1.3 實驗儀器
            4.1.1.4 引物
        4.1.2 實驗方法
            4.1.2.1 雙鏈RNAi探針的制備
            4.1.2.2 RNAi探針的注射
            4.1.2.3 RNAi實驗效果的檢測
    4.2 實驗結(jié)果
        4.2.1 RNAi探針的制備
        4.2.2 熒光定量PCR檢測RNAi探針的沉默效果
        4.2.3 COLⅥ基因沉默后的貝殼超微結(jié)構(gòu)的變化
    4.3 討論
5 PmCOLⅥA4重組蛋白的表達(dá)
    5.1 材料與方法
        5.1.1 實驗材料
            5.1.1.1 實驗試劑
            5.1.1.2 實驗儀器
        5.1.2 實驗方法
            5.1.2.1 pET30- PmCOLⅥA4重組載體的構(gòu)建
            5.1.2.2 PmCOLⅥA4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            5.1.2.3 PmCOLⅥA4重組蛋白的純化
    5.2 實驗結(jié)果
        5.2.1 pET30a- PmCOLⅥA4-1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.2.2 PmCOLⅥA4-1 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
        5.2.3 PmCOLⅥA4-1 蛋白的擴(kuò)大培養(yǎng)
        5.2.4 PmCOLⅥA4-1 蛋白的純化
        5.2.5 Western blotting檢測
    5.3 討論
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄
致謝
作者簡介
導(dǎo)師簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Matrilin家族的研究進(jìn)展[J]. 麥俊妮,陳嬋嬋,凌均棨.  國際口腔醫(yī)學(xué)雜志. 2009(06)
[2]X型膠原蛋白與骨骼生長發(fā)育關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 鄭謙,張筱薇.  國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊. 2002(02)

博士論文
[1]ACCBP對無定形碳酸鈣形成與轉(zhuǎn)化調(diào)控機(jī)制的研究[D]. 蘇境坦.清華大學(xué) 2013

碩士論文
[1]馬氏珠母貝珍珠層基質(zhì)蛋白基因的克隆與功能研究[D]. 董冰冰.廣東海洋大學(xué) 2015
[2]大珠母貝金屬硫蛋白cDNA序列克隆與表達(dá)研究[D]. 唐仁生.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009



本文編號：3674524