發(fā)布時(shí)間：2022-04-17 19:57

　　嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是一種典型的人-獸-魚共患病病原菌,可引起動(dòng)物的敗血癥和人類腹瀉,同時(shí)也是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的條件致病菌,每年由該菌導(dǎo)致的魚類爆發(fā)性流行病給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,引起研究人員的高度重視。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中常常使用抗生素預(yù)防與治療魚類疾病,導(dǎo)致嗜水氣單胞菌等病原菌產(chǎn)生耐藥性。此外,嗜水氣單胞菌在自然環(huán)境中易形成生物被膜,一種與浮游態(tài)相對(duì)應(yīng)的生活方式,在細(xì)菌耐藥與致病過程中發(fā)揮重要作用。因此研究浮游態(tài)和生物被膜狀態(tài)下嗜水氣單胞菌抗生素耐藥相關(guān)蛋白及其功能,對(duì)治療與預(yù)防該菌具有重要的意義。本試驗(yàn)首先采用TMT標(biāo)記結(jié)合LC-MS/MS質(zhì)譜分析的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),以生物被膜狀態(tài)下的嗜水氣單胞菌為研究對(duì)象,對(duì)金霉素（Chlortetracycline, CTC）應(yīng)激與遺傳獲得性耐藥兩種條件下,細(xì)菌表達(dá)差異蛋白進(jìn)行了較系統(tǒng)的比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),應(yīng)激處理下（即Ah-CTC-O+CTC比Ah-CTC-O）共有66個(gè)蛋白發(fā)生變化,其中24個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá),42個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá),而獲得性耐藥性下（即Ah-CTC-R比Ah-CTC-O）有66個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá)... 

【文章頁數(shù)】：85 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略詞
第一章 前言
    1 細(xì)菌耐藥性研究
    2 嗜水氣單胞菌相關(guān)研究
        2.1 嗜水氣單胞菌的危害性
        2.2 嗜水氣單胞菌的耐藥機(jī)制
    3 細(xì)菌生物被膜的研究
        3.1 細(xì)菌生物被膜的形成過程
        3.2 生物被膜的耐藥機(jī)制
        3.3 嗜水氣單胞菌中生物被膜相關(guān)研究
    4 細(xì)菌耐藥性的研究方法
        4.1 基因組學(xué)
        4.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)
        4.3 代謝組學(xué)
        4.4 蛋白質(zhì)組學(xué)
    5 本論文主要研究?jī)?nèi)容及其研究意義
第二章 材料和方法
    1 材料
        1.1 常用試劑來源
        1.2 主要設(shè)備
        1.3 生物材料
        1.4 常用試驗(yàn)試劑配制
            1.4.1 培養(yǎng)基和抗生素配制
            1.4.2 蛋白提取試劑配制
            1.4.3 電泳試劑配制
            1.4.4 酶解、標(biāo)記和除鹽試劑配制
            1.4.5 蛋白純化試劑配制
            1.4.6 ELISA/Western blotting試劑配制
    2 試驗(yàn)方法
        2.1 菌體的培養(yǎng)與收集
        2.2 細(xì)菌全蛋白的提取
            2.2.1 生物被膜狀態(tài)細(xì)菌全蛋白的提取
            2.2.2 浮游態(tài)細(xì)菌全蛋白的提取
        2.3 嗜水氣單胞菌耐藥菌株的篩選
        2.4 藥物敏感實(shí)驗(yàn)
            2.4.1 細(xì)菌MIC的測(cè)定
            2.4.2 細(xì)菌生存率的測(cè)定
            2.4.3 生物被膜狀態(tài)嗜水氣單胞菌在CTC和TCS聯(lián)合作用下生存率的測(cè)定
            2.4.4 高表達(dá)菌株rpll和glms存活率的測(cè)定
        2.5 樣品的酶解和標(biāo)記
            2.5.1 生物被膜細(xì)菌全蛋白樣品的酶解和標(biāo)記
            2.5.2 浮游態(tài)細(xì)菌全蛋白樣品的酶解和標(biāo)記
        2.6 質(zhì)譜分析
        2.7 數(shù)據(jù)處理
        2.8 熒光定量PCR
            2.8.1 引物設(shè)計(jì)
            2.8.2 RNA的提取
            2.8.3 cDNA的合成
            2.8.4 熒光定量PCR
        2.9 目的基因的克隆與表達(dá)
            2.9.1 引物設(shè)計(jì)
            2.9.2 基因克隆與表達(dá)
        2.10 蛋白純化
        2.11 免疫血清的制備
        2.12 ELISA測(cè)定效價(jià)
        2.13 Western blotting分析
第三章 結(jié)果與分析
    第一節(jié) 生物被膜狀態(tài)嗜水氣單胞菌四環(huán)素耐藥相關(guān)蛋白的研究
        1.1 傳代耐藥菌株的篩選
        1.2 生物被膜狀態(tài)下耐藥菌株的生存率
        1.3 利用TMT標(biāo)記結(jié)合LC-MS/MS對(duì)樣品進(jìn)行蛋白鑒定
        1.4 生物被膜狀態(tài)嗜水氣單胞菌應(yīng)激性和獲得性耐藥性的定量蛋白質(zhì)組學(xué)比較分析
        1.5 差異蛋白的功能分類及注釋分析
        1.6 差異蛋白的STRING和KEGG途徑分析
        1.7 蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果驗(yàn)證
        1.8 生物被膜狀態(tài)下CTC和TCS協(xié)同作用抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)
            1.8.1 細(xì)菌存活率的測(cè)定
            1.8.2 mRNA水平上驗(yàn)證脂肪酸生物合成相關(guān)基因
            1.8.3 Western blotting分析
        1.9 討論
    第二節(jié) 浮游態(tài)嗜水氣單胞菌四環(huán)素耐藥相關(guān)蛋白的研究
        2.1 浮游態(tài)耐藥菌株的生存率
        2.2 利用iTRAQ標(biāo)記結(jié)合LC-MS/MS對(duì)樣品進(jìn)行蛋白鑒定
        2.3 浮游態(tài)嗜水氣單胞菌應(yīng)激性和獲得性耐藥的定量蛋白質(zhì)組學(xué)比較
        2.4 差異蛋白的功能分類及注釋分析
        2.5 蛋白的KEGG途徑分析和相互作用網(wǎng)絡(luò)分析
        2.6 蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果驗(yàn)證
            2.6.1 q-PCR驗(yàn)證相關(guān)基因
            2.6.2 Western blotting分析
        2.7 討論
第四章 總結(jié)與展望
    1 總結(jié)
    2 展望
參考文獻(xiàn)
碩士研究生期間發(fā)表的研究論文
會(huì)議摘要
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3646169