中華絨螯蟹“顫抖病”是一種危害極大的水產(chǎn)病害,該病病原為中華絨螯蟹螺原體（Spiroplasma eriocheiris）,螺原體侵染可導(dǎo)致中華絨螯蟹出現(xiàn)附肢顫抖癥狀,一直威脅著中華絨螯蟹、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）、南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）及日本沼蝦（Macrobrachium nipponensis）等水生甲殼動物的養(yǎng)殖。螺原體首先侵染宿主的血淋巴細(xì)胞,然后相繼侵染宿主的肌肉和神經(jīng)等其他組織,最終導(dǎo)致中華絨螯蟹出現(xiàn)附肢顫抖癥狀直至死亡。缺乏適應(yīng)性免疫的中華絨螯蟹可以通過先天免疫系統(tǒng)抵抗病原的入侵,因此在應(yīng)對病原體入侵的研究方面,中華絨螯蟹自身的免疫防御機(jī)制成為一個重要的研究要點。基于本課題組前期i TRAQ的研究結(jié)果,在蛋白水平上篩選到中華絨螯蟹甘露糖結(jié)合蛋白（Mannose-binding protein,EsMBP）是螺原體侵染河蟹的免疫差異蛋白。在證實EsMBP具有重要免疫功能基礎(chǔ)上,本研究主要利用生物信息學(xué)分析、蛋白重組表達(dá)、雙鏈RNA干擾、互作micro... 

【文章來源】：南京師范大學(xué)江蘇省211工程院校

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【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 中華絨螯蟹研究概述
        1.1.1 中華絨螯蟹的分類地位和生物學(xué)特征
        1.1.2 中華絨螯蟹的養(yǎng)殖現(xiàn)狀和面臨問題
        1.1.3 中華絨螯蟹的先天性免疫研究
    1.2 中華絨螯蟹螺原體研究概述
        1.2.1 螺原體的生物學(xué)地位及其致病性
        1.2.2 中華絨螯蟹螺原體的發(fā)現(xiàn)及命名
        1.2.3 中華絨螯蟹螺原體侵染機(jī)理及研究現(xiàn)狀
    1.3 甘露糖結(jié)合蛋白的研究概述
        1.3.1 甘露糖結(jié)合蛋白的簡介
        1.3.2 甘露糖結(jié)合蛋白的功能研究
    1.4 MicroRNA的研究概況
        1.4.1 MicroRNA簡介
        1.4.2 MicroRNA功能研究
    1.5 本論文的研究意義、內(nèi)容和技術(shù)路線
第2章 中華絨螯蟹甘露糖結(jié)合蛋白(EsMBP)基因克隆、序列分析和表達(dá)模式研究
    2.1 實驗材料和方法步驟
        2.1.1 實驗動物和細(xì)菌
        2.1.2 主要實驗器材
        2.1.3 主要實驗試劑
    2.2 實驗步驟
        2.2.1 RACE技術(shù)擴(kuò)增EsMBP基因全長
        2.2.2 EsMBP基因序列特征分析
        2.2.3 EsMBP的組織分布
            2.2.3.1 組織RNA提取
            2.2.3.2 cDNA合成
            2.2.3.3 不同組織中EsMBP基因的表達(dá)檢測
        2.2.4 螺原體刺激后EsMBP表達(dá)模式的分析
            2.2.4.1 螺原體刺激
            2.2.4.2 RT-PCR檢測EsMBP基因表達(dá)量變化
        2.2.5 EsMBP基因克隆
            2.2.5.1 PCR擴(kuò)增EsMBP的 CLECT序列
            2.2.5.2 目的基因的純化
            2.2.5.3 目的基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.5.4 連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至克隆感受態(tài)細(xì)胞
            2.2.5.5 菌落PCR篩選陽性單克隆及測序分析
        2.2.6 EsMBP重組蛋白的表達(dá)、純化及鑒定
            2.2.6.1 重組質(zhì)粒的原核表達(dá)
            2.2.6.2 EsMBP重組蛋白的過柱純化
            2.2.6.3 純化后的重組表達(dá)蛋白Western-blot檢驗
        2.2.7 EsMBP重組蛋白與中華華絨螯蟹螺原體的凝集結(jié)合實驗
        2.2.8 EsMBP多克隆抗體的制備
        2.2.9 螺原體刺激后血淋巴細(xì)胞EsMBP蛋白表達(dá)變化
            2.2.9.1 中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞的原代培養(yǎng)
            2.2.9.2 中華絨螯蟹螺原體刺激后血淋巴細(xì)胞中EsMBP蛋白表達(dá)變化
    2.3 實驗結(jié)果
        2.3.1 EsMBP基因的擴(kuò)增
        2.3.2 EsMBP基因的序列分析
        2.3.3 多序列比對
        2.3.4 EsMBP基因在中華絨螯蟹中的組織分布
        2.3.5 中華絨螯蟹螺原體刺激后EsMBP的表達(dá)變化
        2.3.6 EsMBP原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.7 EsMBP重組蛋白的表達(dá)、純化與鑒定
        2.3.8 EsMBP重組蛋白與中華絨螯蟹螺原體的凝集結(jié)合
        2.3.9 EsMBP多克隆抗體的檢驗
        2.3.10 螺原體刺激后血淋巴細(xì)胞EsMBP蛋白表達(dá)變化
    2.4 討論
第3章 EsMBP在螺原體侵染中華絨螯蟹過程中的功能研究
    3.1 實驗材料和方法步驟
        3.1.1 實驗動物和細(xì)菌
        3.1.2 主要實驗器材
        3.1.3 主要實驗試劑
    3.2 實驗步驟
        3.2.1 EsMBP重組蛋白對螺原體侵染的影響
            3.2.1.1 EsMBP重組蛋白和螺原體的注射
            3.2.1.2 EsMBP重組蛋白對螺原體侵染的影響
            3.2.1.3 EsMBP重組蛋白注射后酚氧化酶活性檢測(PO)
        3.2.2 EsMBP雙鏈RNA合成
            3.2.2.1 EsMBP的 cDNA模板獲取
            3.2.2.2 干擾引物的設(shè)計
            3.2.2.3 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增純化及dsRNA合成
        3.2.3 EsMBP基因干擾
        3.2.4 EsMBP基因干擾效率、PO活性檢測
        3.2.5 EsMBP基因干擾對螺原體侵染的影響
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 EsMBP重組蛋白對中華絨螯蟹體內(nèi)螺原體拷貝數(shù)的影響
        3.3.2 EsMBP重組蛋白和螺原體注射后中華絨螯蟹死亡率統(tǒng)計
        3.3.3 EsMBP重組蛋白注射后酚氧化酶活性檢測(PO)
        3.3.4 EsMBP雙鏈RNA的合成
        3.3.5 EsMBP干擾效率檢測
        3.3.6 EsMBP基因干擾對PO活性及proPO的影響
        3.3.7 EsMBP基因干擾后對中華絨螯蟹螺原體侵染的影響
        3.3.8 EsMBP基因干擾對中華絨螯蟹死亡率的影響
    3.4 討論
第4章 與EsMBP靶向作用的microRNA鑒定及功能研究
    4.1 實驗材料和方法步驟
        4.1.1 實驗動物和細(xì)菌
        4.1.2 主要實驗器材
        4.1.3 主要實驗試劑
    4.2 實驗步驟
        4.2.1 中華絨螯蟹EsMBP與 microRNA的靶向調(diào)控分析
        4.2.2 細(xì)胞熒光和雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建
            4.2.2.1 PCR擴(kuò)增EsMBP的3’UTR序列
            4.2.2.2 熒光質(zhì)粒的酶切和目的片段連接
            4.2.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至克隆感受態(tài)細(xì)胞中
            4.2.2.4 菌落PCR篩選陽性克隆及分析測序
        4.2.3 中華絨螯蟹EsMBP與 microRNA的靶向作用鑒定
            4.2.3.1 EsMBP熒光質(zhì)粒與microRNA的共轉(zhuǎn)染
            4.2.3.2 雙熒光素酶報告基因檢測
            4.2.3.3 細(xì)胞熒光檢測
        4.2.4 EsMBP與 microRNA的靶向作用驗證
        4.2.5 microRNA作用于血淋巴細(xì)胞后EsMBP蛋白表達(dá)量變化
        4.2.6 EsMBP與 microRNA靶向作用PO活性檢測
        4.2.7 EsMBP與 microRNA靶向作用對螺原體侵染的影響
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 EsMBP與 microRNA的靶向作用分析
        4.3.2 細(xì)胞熒光和雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.3 雙熒光素酶報告基因檢測
        4.3.4 細(xì)胞熒光檢測
        4.3.5 EsMBP-3’UTR與 miR-381-5p的突變分析
        4.3.6 EsMBP-3’UTR與 miR-381-5p靶向作用驗證
        4.3.7 EsMBP在中華絨螯蟹血淋巴細(xì)胞中表達(dá)變化
        4.3.8 EsMBP與 microRNA靶向作用PO活性檢測
        4.3.9 microRNA作用下中華絨螯蟹螺原體侵染后血淋巴細(xì)胞形態(tài)的觀察
        4.3.10 microRNA作用下螺原體侵染后血淋巴細(xì)胞活力的檢測
        4.3.11 microRNA作用下螺原體侵染血淋巴細(xì)胞后螺原體拷貝數(shù)檢測
    4.4 討論
第5章 結(jié)論
    5.1 EsMBP序列分析及表達(dá)模式等功能研究
    5.2 EsMBP在螺原體侵染過程的功能研究
    5.3 microRNA與 EsMBP靶向作用在螺原體侵染過程中的功能研究
參考文獻(xiàn)
在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]水生無脊椎動物血淋巴細(xì)胞分類及免疫研究進(jìn)展[J]. 吳芳麗,王月,尚躍勇,嚴(yán)桂珍,孔輝,胡夢紅,呂為群,王有基.  大連海洋大學(xué)學(xué)報. 2016(06)
[2]中華絨螯蟹[J]. 丁德明.  湖南農(nóng)業(yè). 2015(11)
[3]甲殼動物RNAi技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展[J]. 邱錫爾,朱冬發(fā),周彥琦,柳志業(yè),謝熙.  生物技術(shù)通報. 2015(03)
[4]長江水系中華絨螯蟹種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J]. 李曉暉,許志強(qiáng),葛家春,朱清順,潘建林.  水產(chǎn)養(yǎng)殖. 2009(10)
[5]螺原體的分類及其生物多樣性研究進(jìn)展[J]. 于漢壽,劉淑園,阮康勤,陳永萱,王志偉.  微生物學(xué)報. 2009(05)
[6]無脊椎動物先天免疫模式識別受體研究進(jìn)展[J]. 王金星,趙小凡.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2004(02)
[7]患“顫抖病”中華絨螯蟹血細(xì)胞中類立克次體寄生的超微結(jié)構(gòu)觀察[J]. 朱寧寧,王文,李正榮,顧志鋒.  電子顯微學(xué)報. 2002(01)
[8]患顫抖病中華絨螯蟹體內(nèi)類立克次體侵染的光鏡和電鏡觀察[J]. 王文,顧志峰,朱寧寧,李正榮,杜開和,徐在寬.  中國水產(chǎn)科學(xué). 2001(04)
[9]甲殼動物細(xì)胞及體液免疫機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 徐海圣,徐步進(jìn).  大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報. 2001(01)
[10]蝦類血細(xì)胞及體液免疫的研究現(xiàn)狀[J]. 王建平,吳雄飛.  浙江海洋學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版). 2000(04)

博士論文
[1]中華絨螯蟹螺原體侵染羅氏沼蝦血細(xì)胞過程中互作蛋白的篩選及功能研究[D]. 修云吉.南京師范大學(xué) 2015

碩士論文
[1]中華絨螯蟹Rab7和14-3-3Z蛋白在螺原體入侵過程中的免疫功能研究[D]. 許學(xué)川.南京師范大學(xué) 2019
[2]綿羊MBL基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及抗病相關(guān)miRNA的篩選[D]. 金遵.石河子大學(xué) 2016



本文編號：3640865