弧菌（Vibrio）是自然物種多樣化的細(xì)菌,主要棲息于水體和水生動(dòng)物中。分離到的弧菌中有70%以上是霍亂弧菌、副溶血孤菌和創(chuàng)傷弧菌,這些弧菌不僅對(duì)動(dòng)物有致病性,還對(duì)人類健康有很大的威脅。被霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌感染的主要原因是吃了被污染的海產(chǎn)品和傷口暴露于水環(huán)境。其中副溶血弧菌是引起食源性細(xì)菌胃腸炎的最主要原因,主要的毒力因子是耐熱直接溶血素（TDH）和耐熱相關(guān)溶血素（TRH）。根據(jù)霍亂弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌groEL基因序列設(shè)計(jì)三對(duì)引物分別為groVc、groVp和groVv,建立同時(shí)檢測(cè)三種弧菌多重PCR方法,經(jīng)過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化,獲得最佳反應(yīng)體系為（25μL）:PCR Mix 10μL,上下游引物（10pmM）各0.5μL,模板2gL,用ddH2O調(diào)整終體積至25μL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s；退火溫度66℃,退火時(shí)間30s；72℃延伸30s,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5min。檢測(cè)結(jié)果表明該檢測(cè)方法具有較高的特異性,對(duì)目標(biāo)菌株DNA的檢測(cè)靈敏度分別為霍亂弧菌1ng/μL,副溶血弧菌1ng/μL,創(chuàng)傷弧菌1ng/μL。該方法能同時(shí)檢測(cè)到三種弧... 

【文章來(lái)源】：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：75 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖３－１?ｇｒｏＶｐ對(duì)副諧血弧園的特異性檢測(cè)??－

２．３多重ＰＣ民體系優(yōu)化??反應(yīng)體系中模板各加ｌ＾ｉＬ，退火溫度在６５１：－６７’（：時(shí)，有比較明顯的呈條目的條??帶（圖３－５）；反應(yīng)體系中加入的模板都是沖Ｌ，退火溫度在６５°Ｃ－６８°Ｃ時(shí)，有比較明??顯的目的條帶（圖３－６）。通過(guò)比較兩個(gè)圖的結(jié)果選擇反應(yīng)體系：ＰＣ艮Ｍｉｘ?ｌＯｉａＬ，上??下游引物（ｌＯｐｍＭ）各０．５咕，模板２陣，用加＆０調(diào)整終體積至２５陣，退火溫度為??６６Ｘ：。?．或??退火時(shí)間優(yōu)化結(jié)果，當(dāng)退火時(shí)間在１５ｓ和２５ｓ時(shí)，創(chuàng)傷弧菌對(duì)應(yīng)的產(chǎn)物條帶凡乎??沒(méi)有，退火時(shí)間在３化和４５ｓ時(shí)均有三條目的條帶（圖３－７），考慮檢測(cè)的快捷原則，??選退火時(shí)間為３化。??多重ＰＣ民反應(yīng)體系的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果，循環(huán)參數(shù)為２０和４０時(shí)只有２??條目的條帶，循環(huán)參數(shù)在２５、３０和％時(shí)，Ｈ條目的條帶都出現(xiàn)，其中循環(huán)參數(shù)為３０??時(shí)王條目的條帶最明顯（圖３－８），為最佳循環(huán)參數(shù)。??綜上所述

２．２單重ＰＣＲ靈敏度檢測(cè)??和ｔｏｄ？?Ｈ對(duì)引物分別對(duì)副溶血弧菌靈敏度的檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)到的ＤＮＡ??最低濃度均為ｌｘｌ〇－２ｎｇ４ｉＬ?（圖４－４），結(jié)果表明在單重ＰＣ民檢測(cè)中吉對(duì)引物都有??較高的靈敏度。??Ｍ?１?２３４５６７８９?１０?Ｍ?１?２３４５６７８９?１０?Ｍ１２３４５６７８９?１０??２５０ｂｐ?；?．．１??Ａ．化／ｉ責(zé)敏度檢測(cè)?Ｂ．?ｆ妍靈敏度檢測(cè)?Ｃ．儀Ｉ訴員敏度檢測(cè)??圖４－４?Ｈ對(duì)引物靈敏度檢測(cè)結(jié)果?聾??Ｆｉｇ．４－４?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?比ｒｅｅ?ｐａｉｒｓ?ｏｆ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ?化Ｓｔ??Ｍ：?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００ｂｐ；?１：?Ｉ００ｎｇ／｜ｉＬ；?２：?１０?ｎｇ／ｆｉＬ；?３：?１?４：?ｌｘｉ〇－ｉ?ｎｇ／ｆｉＬ；?５：?ｌｘｌ〇－２?ｎｇ／沖；６：?ｌｘ?１０＇＾??ｎｇ／咕；７：?ｌｘｉ（ｒ＊ｎｇ／陣；８：?ｌｘｌ〇－５ｎｇ／扣；９：?Ｉｘｌ〇－６ｎｇ／沖；１０；陰性對(duì)照?’??２．３多重ＰＣ民體系優(yōu)化??反應(yīng)體系中上下游引物均為化非Ｌ，模板各加ｌ｜ｉＬ，退火溫度在５５°Ｃ－６５°Ｃ時(shí)，只??有ｔｏｅ／？擴(kuò)增出比較明顯的目的條帶，其它兩對(duì)引物均未出現(xiàn)明顯的目的條帶（圖４－５）；??反應(yīng)體系中上下游引物分別為：仿Ａ２［ｉＬ，／加０．５沖，化）（：７？０．５畔；加入２｜ａＬ的模板，??退火溫度在５５’Ｃ－６６’Ｃ時(shí)，Ｈ對(duì)引物均出現(xiàn)較明顯的目的條帶（圖４－６）。通過(guò)比較兩??個(gè)圖的結(jié)果選擇反應(yīng)體系：ＰＣ民ＭｉｘｌＯｉｉｉ＾上下游引物（ｌＯｐｍＭ）分別為：訊Ａ２）ａＬ，??細(xì)０．５陣

【參考文獻(xiàn)】：
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碩士論文
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