羅非魚是我國重要的養(yǎng)殖品種之一,在我國南方廣泛養(yǎng)殖。2009年以來我國南方主養(yǎng)區(qū)羅非魚大范圍暴發(fā)鏈球菌病,鏈球菌病的主要病原有海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）和無乳鏈球菌（S.agalactiae）。目前針對羅非魚無乳鏈球菌病尚無科學(xué)有效的防治措施,主要依賴抗生素類化學(xué)藥物進(jìn)行防治,易導(dǎo)致菌株耐藥和藥物殘留。疫苗具有安全、高效、無殘留等優(yōu)點(diǎn),可替代抗生素類藥物成為羅非魚鏈球菌病防控的重要途徑。目前已有無乳鏈球菌滅活疫苗、減毒疫苗、DNA疫苗和基因工程亞單位疫苗等多種疫苗的報道,但其具有一定的局限性,使之不能進(jìn)行大面積的推廣。研制免疫方便、效果較好、易于工業(yè)化生產(chǎn)的新型疫苗已經(jīng)成為防控羅非魚鏈球菌病的主要趨勢。本研究構(gòu)建了重組表達(dá)無乳鏈球菌表面免疫原性蛋白（Surface immunogenic protein,Sip）的乳酸菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒,制備成乳酸菌活載體疫苗,通過灌胃口服的方式對其免疫原性進(jìn)行了研究。研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1尼羅羅非魚無乳鏈球菌Sip基因穿梭表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及原核表達(dá)構(gòu)建重組表達(dá)無乳鏈球菌Sip蛋白的分泌型穿梭表達(dá)質(zhì)粒pNZ8124-Sip和非分泌型... 

【文章來源】：上海海洋大學(xué)上海市

【文章頁數(shù)】：87 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

無乳鏈球菌Sip基因片段的PCR產(chǎn)物M．DNAMarkerDL2000；1.2.3.4.Sip基因PCR產(chǎn)物

上海海洋大學(xué)碩士論文26圖1-2 重組表達(dá)質(zhì)粒pNZ8148-Sip的雙酶切鑒定和PCR鑒定M．DNA Marker DL5000； 1．pNZ8148經(jīng)Kpn I單酶切； 2.陽性克隆中擴(kuò)增的Sip基因；3.pNZ8148-sip KpnI和Hind III雙酶切；4．pNZ8148-sip經(jīng)Kpn I單酶切Fig.1-2 Digestion and PCR identification of recombinant plasmid pNZ8148-sipM. DNA Marker DL5000; 1. recombinant plasmid of pNZ8148 digested by Kpn I; 2.PCR product of Sip gene;3.pNZ8148-sip digested by Kpn I and Hind III; 4. pNZ8148-sip digested by Kpn I構(gòu)建的pNZ8124-sip質(zhì)粒經(jīng)Kpn I 、Hind III雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示有3260bp和1265bp左右的2條條帶，分別與pNZ8124載體、PCR擴(kuò)增的Sip片段大小一致( 圖1-3) ，將經(jīng)酶切、菌液PCR鑒定正確的重組質(zhì)粒送樣測序，結(jié)果與預(yù)測序列一致，說明本研究成功構(gòu)建了尼羅羅非魚無乳鏈球菌Sip蛋白乳酸菌重組表達(dá)質(zhì)粒pNZ8124-sip。

上海海洋大學(xué)碩士論文27圖1-3 重組表達(dá)質(zhì)粒pNZ8124-sip的雙酶切鑒定和PCR鑒定M．DNA Marker DL5000； 1．pNZ8124經(jīng)KpnI單酶切； 2.陽性克隆中擴(kuò)增的Sip基因；3.pNZ8124-sip Kpn I和Hind III雙酶切；4．pNZ8124-sip經(jīng)Kpn I單酶切Fig.1-3 Digestion and PCR identification of recombinant plasmid pNZ8124-sipM. DNA Marker DL5000; 1. recombinant plasmid of pNZ8124 digested by Kpn I; 2.PCR productof sip gene; 3.pNZ8124-sip digested by Kpn I and Hind III; 4. pNZ8124-sip digested by Kpn I2.3 Sip蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的最佳條件及其主要存在形式2.2.1 NZ9000-pNZ8148-sip中Sip蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化及其主要存在形式30 ℃條件下誘導(dǎo)4 h，nisin誘導(dǎo)劑濃度為0、1ng/mL時重組乳酸菌無相應(yīng)的特異條帶出現(xiàn)，而nisin濃度為10、50、100、500、1000ng/mL時均有特異性條帶，且在nisin濃度為100ng/mL時條帶最明顯，條帶在45KDa左右，大小與Sip目的蛋白分子量預(yù)期大小相符，說明nisin濃度為100ng/mL為最佳誘導(dǎo)濃度，也說明了重組蛋白在乳酸菌NZ9000表達(dá)載體中成功表達(dá)（圖1-4）。在獲得最佳誘導(dǎo)濃度的前提下

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]羅非魚源無乳鏈球菌嵌合型亞單位疫苗與DNA疫苗的研制及免疫效果評價[D]. 李桂歡.廣東海洋大學(xué) 2014
[2]廣西羅非魚無乳鏈球菌病病原分離、鑒定及毒力基因檢測分析[D]. 彭民毅.廣西大學(xué) 2014
[3]乳酸乳球菌usp45基因的功能研究及其在表達(dá)載體構(gòu)建中的應(yīng)用[D]. 葉飛.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 2014
[4]羅非魚無乳鏈球菌病DNA疫苗的研究及有效中草藥的篩選[D]. 劉亮.中山大學(xué) 2013
[5]海南羅非魚鏈球菌病病原分離鑒定及防治中草藥篩選[D]. 鄧恒為.海南大學(xué) 2013
[6]羅非魚源無乳鏈球菌滅活疫苗的研制及其免疫效果的研究[D]. 陳賀.廣東海洋大學(xué) 2012
[7]廣西羅非魚產(chǎn)業(yè)化發(fā)展現(xiàn)狀的研究[D]. 唐瞻楊.廣西大學(xué) 2012
[8]羅非魚無乳鏈球菌的分離、鑒定及重組表面免疫原性蛋白His-Sip的免疫效果初步研究[D]. 黎炯.上海海洋大學(xué) 2011
[9]鯉魚新型免疫球蛋白IgT的粘膜免疫功能研究[D]. 呂翠.山東師范大學(xué) 2011
[10]雜交羅非魚（Oreochromis niloticus × O.aureus）對動物蛋白源的利用研究[D]. 陸炳招.廣東海洋大學(xué) 2010



本文編號：3590305