雙組分調(diào)控系統(tǒng)（Two-component Regulatory System）在致病菌的生長及毒力調(diào)控中起重要作用。本研究克隆了溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901株組氨酸激酶KdpD和反應(yīng)調(diào)控因子KdpE的全長基因,并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。序列分析結(jié)果顯示,kdpD（GenBank登錄號:KJ544668）全長1374 bp,共編碼457個(gè)氨基酸;kdpE（GenBank登錄號:KJ476728）全長732 bp,編碼243個(gè)氨基酸。構(gòu)建KdpD和KdpE的系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果顯示溶藻弧菌KdpD和KdpE與坎氏弧菌（V.campbellii）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）相應(yīng)蛋白有較近親緣關(guān)系。利用SWISS-MODEL軟件,對KdpD/KdpE中兩個(gè)相對保守的功能域HATPase_c和REC進(jìn)行同源建模。本研究采用Overlap PCR和同源重組技術(shù),結(jié)合正負(fù)向篩選,構(gòu)建三株無標(biāo)記基因框內(nèi)敲除突變株:ΔkdpDE、ΔkdpD和ΔkdpE,比較突變株和野生株HY9901在生長速率、胞外蛋白酶活性以及毒力等方面的差... 

【文章來源】：廣東海洋大學(xué)廣東省

【文章頁數(shù)】：62 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 弧菌及弧菌病
        1.1.1 常見弧菌病
        1.1.2 溶藻弧菌
        1.1.4 哈維氏弧菌
    1.2 雙組分調(diào)控系統(tǒng)（Two component regulatory systems, TCRS）
        1.2.1 雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpDE
    1.3 疫苗
        1.3.1 滅活疫苗
        1.3.2 減毒活疫苗
        1.3.3 亞單位疫苗
        1.3.4 核酸疫苗
        1.3.5 合成肽疫苗
        1.3.6 魚類疫苗接種方法
    1.4 斑馬魚在魚類疫苗研究中的應(yīng)用
    1.5 技術(shù)路線
    1.6 研究目的以及意義
2 溶藻弧菌kdpD和kdpE基因的克隆及序列分析
    2.1 材料
        2.1.1 菌株和載體
        2.1.2 主要試劑及載體
        2.1.3 主要儀器
    2.2 方法
        2.2.1 V. alginolyticus HY9901株細(xì)菌總DNA的提取
        2.2.2 kdpD和kdpE基因的克隆
        2.2.3 目的片段的連接和測序
        2.2.4 生物信息學(xué)分析
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 kdpD和kdpE基因的全長克隆
        2.3.2 理化性質(zhì)
        2.3.3 序列分析
        2.3.4 進(jìn)化分析
        2.3.5 功能結(jié)構(gòu)域和二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測
        2.3.6 保守功能域三維結(jié)構(gòu)
    2.4 討論
3 突變株ΔkdpDE、ΔkdpD和ΔkdpE的構(gòu)建
    3.1 材料
        3.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物
        3.1.2 試劑及儀器
    3.2 方法
        3.2.1 敲除突變株ΔkdpDE、ΔkdpD和ΔkdpE的構(gòu)建
    3.3 結(jié)果
        3.3.1 敲除突變株△kdpD的構(gòu)建
        3.3.2 敲除突變株ΔkdpE和ΔkdpDE的構(gòu)建
    3.4 討論
4 生物學(xué)表型特征研究
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 菌株
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        4.1.3 主要試劑
    4.2 方法
        4.2.1 突變株的遺傳穩(wěn)定性檢測
        4.2.2 細(xì)菌的生長速率比較
        4.2.3 胞外蛋白酶活性檢測
        4.2.4 細(xì)菌泳動實(shí)驗(yàn)
        4.2.5 生物被膜形成能力檢測
        4.2.6 半數(shù)致死率（LD50）檢測
        4.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    4.3 結(jié)果
        4.3.1 突變株的遺傳穩(wěn)定性
        4.3.2 細(xì)菌的生長速率比較
        4.3.3 泳動性實(shí)驗(yàn)
        4.3.4 生物被膜形成能力檢測
        4.3.5 半數(shù)致死量測定LD50
    4.4 討論
5 突變株在水體和魚體中的存活能力檢測及其免疫保護(hù)效果分析
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 菌株、質(zhì)粒和實(shí)驗(yàn)魚
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑
    5.2 方法
        5.2.1 突變株在水體中的存活能力檢測
        5.2.2 突變株在魚體內(nèi)的存活能力檢測
        5.2.3 菌液的制備與接種
        5.2.4 免疫保護(hù)率的測定
        5.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    5.3 結(jié)果
        5.3.1 突變株在水體中的存活能力檢測
        5.3.2 突變株在魚體內(nèi)的存活能力檢測
        5.3.3 免疫保護(hù)率
    5.4 討論
6 結(jié)論
    6.1 溶藻弧菌雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpDE基因的克隆和生物信息學(xué)分析
    6.2 無標(biāo)記基因框內(nèi)敲除突變株的構(gòu)建
    6.3 突變株△kdpDE、△kdpD和△kdpE的生物學(xué)表型特征研究
    6.4 突變株在水體和魚體中的存活能力檢測及其免疫保護(hù)效果分析
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡介
導(dǎo)師簡介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：3559412