克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）又稱小龍蝦,在分類學(xué)上隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱,是一種重要的淡水養(yǎng)殖蝦品種。在其整個生命周期中,蛻皮次數(shù)高達(dá)十幾次,且只有經(jīng)過蛻皮才能實(shí)現(xiàn)性成熟。而蛻皮受到多種因素的調(diào)控,其中消化酶類扮演者重要的角色。本研究克隆了克氏原螯蝦α-淀粉酶基因并分析了蛻皮激素對α-淀粉酶表達(dá)水平的影響。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)已有部分序列,設(shè)計特異性引物克隆出克氏原螯蝦α-淀粉酶ORF（open reading frame）c DNA序列。生物信息學(xué)分析表明克氏原螯蝦α-淀粉酶ORF長1545bp,編碼的蛋白質(zhì)含514個氨基酸殘基,其氨基端19個疏水性氨基酸殘基為信號肽。預(yù)測的成熟蛋白的理論相對分子量為55.1 k Da,等電點(diǎn)為4.95.通過雙酶切法構(gòu)建重組質(zhì)粒p ET-28a-amy,轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta（DE3）,用不同濃度IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳和Western blot的檢測結(jié)果表明克氏原螯蝦α-淀粉酶融合蛋白能夠在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá),但是重組蛋白質(zhì)主要以包涵體形式存在。用Ni-NTA親和層析柱對α-淀粉酶重組蛋白包涵體進(jìn)行... 

【文章來源】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)安徽省

【文章頁數(shù)】：46 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
1 文獻(xiàn)綜述
    1.1 α-淀粉酶概述
    1.2 甲殼動物蛻皮周期及調(diào)控機(jī)理
        1.2.1 蛻皮周期劃分
        1.2.2 蛻皮的調(diào)控機(jī)理
2 引言
    2.1 研究的目的及意義
    2.2 研究內(nèi)容
        2.2.1 Pc-amy原核表達(dá)及多抗制備
        2.2.2 Pc-amy組織特異性表達(dá)分析
        2.2.3 蛻皮激素對Pc-amy表達(dá)影響
        2.2.4 重組Pc-Amy蛋白酶活測定
    2.3 技術(shù)路線
3 材料與方法
    3.1 試驗(yàn)材料
    3.2 儀器與試劑
        3.2.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器
        3.2.2 主要生化試劑
        3.2.3 常用溶液的配制
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 α-淀粉酶基因的克隆
            3.3.1.1 總RNA的提取
            3.3.1.2 RNA質(zhì)量檢測
            3.3.1.3 cDNA合成
            3.3.1.4 引物設(shè)計和PCR擴(kuò)增
            3.3.1.5 PCR產(chǎn)物的純化
            3.3.1.6 目的片段與pMD-19T連接和轉(zhuǎn)化
            3.3.1.7 序列分析
        3.3.2 α-淀粉酶基因原核表達(dá)
            3.3.2.1 質(zhì)粒抽提
            3.3.2.2 目的片段和pET-28a的雙酶切
            3.3.2.3 連接目的基因和表達(dá)載體
            3.3.2.4 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.3 重組蛋白的鑒定及純化
            3.3.3.1 SDS-PAGE電泳檢測
            3.3.3.2 重組蛋白的純化
            3.3.3.3 Western blot分析
        3.3.4 蛋白定量
        3.3.5 多克隆抗體制備
            3.3.5.1 免疫動物及抗血清的收集
            3.3.5.2 ELISA測抗體效價
        3.3.6 α-淀粉酶基因的組織表達(dá)特異性分析
            3.3.6.1 各組織總RNA的提取
            3.3.6.2 各組織總蛋白的抽取
            3.3.6.3 α-淀粉酶基因熒光定量PCR分析
            3.3.6.4 α-淀粉酶蛋白的Western blot分析
        3.3.7 蛻皮激素處理對Pc-amy表達(dá)的影響
        3.3.8 重組蛋白質(zhì)復(fù)性及酶活分析
            3.3.8.1 重組蛋白Pc-Amy復(fù)性
            3.3.8.2 重組蛋白Pc-Amy酶活測定
4 結(jié)果與分析
    4.1 總RNA的檢測
    4.2 Pc-amy基因的ORF序列克隆
    4.3 Pc-amy序列分析
    4.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建
    4.5 重組蛋白His6-Amy表達(dá)與純化
        4.5.1 重組蛋白表達(dá)
        4.5.2 重組蛋白純化
    4.6 Bradford法蛋白定量
    4.7 多克隆抗體制備
    4.8 Pc-amy組織特異性表達(dá)分析
    4.9 蛻皮激素處理對Pc-amy表達(dá)的影響
    4.10 重組蛋白復(fù)性及酶活分析
5 討論
    5.1 α-淀粉酶基因的序列分析
    5.2 α-淀粉酶的原核表達(dá)
    5.3 α-淀粉酶的組織特異性分析
    5.4 蛻皮激素對 α-淀粉酶表達(dá)水平的影響
6 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
個人簡介
讀研期間的研究成果



本文編號：3462554