殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida）是一種常見革蘭氏陰性條件致病菌,宿主譜十分廣,它能夠感染多種魚類。該菌感染范圍廣,傳染能力強(qiáng),能夠引起魚類系統(tǒng)性的出血性敗血癥、造成皮膚損傷,還能引起魚類的各器官壞死潰瘍,對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)行業(yè)危害巨大。目前,抗生素依然是治療殺魚愛德華氏菌病的主要重要手段,而抗生素的濫用導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥性,現(xiàn)在甚至已經(jīng)出現(xiàn)了多重耐藥菌株。隨著致病菌對(duì)抗生素的敏感程度越來越低,疫苗免疫更加受到人們的重視,通過基因工程技術(shù)構(gòu)建的弱毒疫苗能有效刺激機(jī)體系統(tǒng)免疫應(yīng)答,以浸泡、注射、口服多種途徑對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物提供持久的免疫保護(hù)。crp基因編碼蛋白c AMP受體蛋白（c AMP receptor protein,Crp）,最早是在大腸桿菌分解代謝產(chǎn)物阻遏過程中被鑒定,隨后發(fā)現(xiàn)它屬于細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄激活蛋白。有大量研究表明Crp與細(xì)菌生長代謝和毒力調(diào)控相關(guān),crp基因缺失后細(xì)菌毒力下降,具備成為減毒活疫苗的潛力。本課題通過同源重組的方法敲除殺魚愛德華氏菌crp基因獲得Δcrp基因缺失株,并對(duì)Δcrp的生物學(xué)特性、毒力和免疫保護(hù)力進(jìn)行研究。主要結(jié)果如下:1、Δcrp基因缺失... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

殺魚愛德華氏菌的感染過程（Leungetal2012）

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士研究生學(xué)位論文14其涂布在鋪有醋酸纖維薄膜的DAP+LA的平板上28℃培養(yǎng)12h。（6）用1mL含Mg2+的LB將醋酸纖維薄膜貼上的菌落沖洗下來，吸取菌液涂布在LA+Cm平板上。（7）挑取LA+Cm平板上單菌落轉(zhuǎn)接到新的LA+Cm平板上，同時(shí)使用P1/P4引物PCR驗(yàn)證單交換，符合期望的單交換菌株命名為WT-pRE112-Δcrp。2.2.9傳代與驗(yàn)證（1）將成功得到單交換后，轉(zhuǎn)接到LB+7%蔗糖培養(yǎng)基中，進(jìn)行傳代操作，每次傳代間隔時(shí)間為12h。（2）每一代根據(jù)菌量進(jìn)行倍比稀釋得到合適濃度，吸取一定量菌液涂布在LA+7%蔗糖平板，隨機(jī)挑取子代平板上的菌落同時(shí)轉(zhuǎn)接到LA和LA+Cm平板的相同位置并做標(biāo)記，28℃過夜培養(yǎng)。（3）挑選出LA+Cm平板不能生長，而LA平板能生長的單菌落，轉(zhuǎn)接到新的LA+Cm平板上，同時(shí)使用P1和P4引物PCR驗(yàn)證缺失株，若符合期望將其命名為Δcrp。2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析2.3.1目的基因crp上下游同源臂的擴(kuò)增以殺魚愛德華氏菌野生株總DNA為模板，引物P1/P2和P3/P4分別擴(kuò)增crp基因上下游同源臂，分別獲得的600bp左右的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與預(yù)期結(jié)果（593bp與579bp）一致（圖2.1），表明crp基因上下游同源臂擴(kuò)增成功。圖2.1目的基因上下游同源臂擴(kuò)增M121000bp500bp

Fig.2.1 Amplification of the up stream and down stream homologous armsM 是 Marker；泳道 1 是基因上游同源臂；泳道 2 是基因下游同源臂M:Marker；Lane1:Upstream arm；Lane2:Downstream arm2.3.2 目的基因 crp 上下游同源臂擴(kuò)增產(chǎn)物的 overlap PCR將上下游同源臂 PCR 產(chǎn)物按 1:1 比例混合后作為模板，引物 P1/P4 進(jìn)行overlap PCR 擴(kuò)增，將上下游同源臂連接，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小介于 1000 bp至 2000 bp 之間，與理論大小 1172 bp 一致，表明 overlap PCR 成功獲得上下游同源臂連接產(chǎn)物。M 1 2

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]水產(chǎn)疫苗研究開發(fā)現(xiàn)狀與趨勢(shì)分析[J]. 王忠良,王蓓,魯義善,吳灶和.  生物技術(shù)通報(bào). 2015(06)



本文編號(hào)：3461907