傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為,胞內(nèi)存活是專性胞內(nèi)致病菌致病過(guò)程中重要的一個(gè)環(huán)節(jié),是專性胞內(nèi)菌為抵抗宿主巨噬細(xì)胞的殺滅作用及進(jìn)一步傳播感染形成的策略。但是近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),非專性胞內(nèi)菌也可以在巨噬細(xì)胞中存活,并且病原菌胞內(nèi)存活能力是決定致病菌毒力的一個(gè)重要因子。然而非專性胞內(nèi)菌在吞噬細(xì)胞內(nèi)存活的研究目前主要局限于金黃色葡萄球菌,其他非專性胞內(nèi)菌吞噬細(xì)胞內(nèi)存活的研究還鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),水產(chǎn)動(dòng)物病原性嗜水氣單胞菌可以在宿主魚(yú)鰻鱺的吞噬細(xì)胞中存活一定時(shí)間,但對(duì)其存活的機(jī)制的研究才剛剛起步。因此,本研究繼續(xù)以從患病鰻鱺中分離得到的嗜水氣單胞菌作為研究對(duì)象,探索該病原菌在宿主巨噬細(xì)胞中存活的分子機(jī)制。首先采用Mini-Tn10轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變技術(shù)構(gòu)建了嗜水氣單胞菌胞內(nèi)存活突變體庫(kù),并從中篩選了2株胞內(nèi)存活能力下降并表現(xiàn)穩(wěn)定的突變株M85和M159。通過(guò)PCR鑒定和Southern blot雜交驗(yàn)證了這兩株突變株均是由Mini-Tn10單位點(diǎn)插入突變的。接著,我們采用TAIL-PCR技術(shù)分別擴(kuò)增突變株轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)側(cè)翼的序列,通過(guò)測(cè)序與拼接,獲得目的基因全長(zhǎng)序列。經(jīng)在線BLAST比對(duì),結(jié)果表明:M8... 

【文章來(lái)源】：集美大學(xué)福建省

【文章頁(yè)數(shù)】：63 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

pLOF/Km質(zhì)粒電泳圖

碩士學(xué)位論文 Hr 基因和 ilvB-1 基因在嗜水氣單胞菌胞內(nèi)存活中 巨噬細(xì)胞的提取與分離 34%/51%percoll 不連續(xù)密度梯度離心法分離腎臟巨噬細(xì)胞，從圖 2噬細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的比例很高，每尾約 500g 鰻鱺能夠分離分離得lls/ml 的巨噬細(xì)胞，且細(xì)胞活性能達(dá)到 99%以上。

圖 2.2 巨噬細(xì)胞光學(xué)顯微鏡下照片（400 倍）2.3.3 胞內(nèi)存活突變株的篩選利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變構(gòu)建突變體庫(kù)，并篩選嗜水氣單胞菌胞內(nèi)存活能力下降的突變株。構(gòu)建的突變體庫(kù)中共有 160 株突變株，通過(guò)胞內(nèi)存活試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其中有兩株突變株85 號(hào)和 159 號(hào)胞內(nèi)存活能力明顯下降并且表現(xiàn)穩(wěn)定，如圖 2.3。其中 85 號(hào)突變株在巨噬細(xì)胞內(nèi) 1h 后，76.9%的嗜水氣單胞菌被殺滅，存活率為 23.1%，159 號(hào)突變株存活率為 20%，而野生型嗜水氣單胞菌的存活率可達(dá)到 50%，差異性分析顯示 85 號(hào)和 159 號(hào)突變株與野生株存在極顯著性差異（P<0.01，不同大寫(xiě)字母表示差異極顯著）。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]嗜水氣單胞菌外膜蛋白o(hù)mpA基因的原核表達(dá)及免疫保護(hù)性研究[J]. 鄭宗林,鄭曙明,Delbert M.Gatlin Ⅲ,汪開(kāi)毓.  淡水漁業(yè). 2015(05)
[2]嗜水氣單胞菌氣溶素的原核表達(dá)及其多克隆抗血清的制備[J]. 杜娜,顧澤茂,袁軍法,林蠡,翟艷花,劉學(xué)芹,羅宇良.  華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2014(03)
[3]嗜水氣單胞菌毒力因子研究進(jìn)展[J]. 李紹戊,盧彤巖.  水產(chǎn)學(xué)雜志. 2013(05)
[4]γ-干擾素對(duì)溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）在青石斑魚(yú)（Epinephelus awoara）巨噬細(xì)胞胞內(nèi)存活的影響[J]. 林桂芳,陳文博,蘇永全,覃映雪,徐曉津,馬英,鄢慶枇.  海洋與湖沼. 2013(05)
[5]Molecular Characterization and Virulence Genes of Aeromonas hydrophila Isolated from the Chinese Giant Salamander （Andrias davidianus）[J]. Li WANG,Yong WEI,Guiping YUAN,Min DAI,Xueliang CHEN.  Asian Herpetological Research. 2012(04)
[6]嗜水氣單胞菌毒力因子及病害控制技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 蔣啟歡,葉應(yīng)旺,胡王,江河,陸劍鋒.  現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技. 2012(06)
[7]斑鱧嗜水氣單胞菌病病原的鑒定及其病理組織學(xué)的研究[J]. 陳言峰,馬文山,陳文慧,梁日深,廖富蘋(píng),鄒記興.  大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào). 2011(06)
[8]嗜水氣單胞菌相關(guān)毒力基因的研究進(jìn)展[J]. 李文艷,張偉偉,馬秀娟,于建芳.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2011(09)
[9]日本鰻鱺腐皮病病原菌的分離及鑒定[J]. 張偉妮,朱志華,陳智偉,梅景良,林旋.  淡水漁業(yè). 2010(02)
[10]嗜水氣單胞菌毒力因子特性及作用機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 邱軍強(qiáng),楊先樂(lè),程訓(xùn)佳.  中國(guó)病原生物學(xué)雜志. 2009(08)

博士論文
[1]miR-200a在抑制成體肝干細(xì)胞惡性表型和功能中的調(diào)控作用及其機(jī)制研究[D]. 劉杰.第四軍醫(yī)大學(xué) 2014

碩士論文
[1]新型時(shí)間分辨熒光免疫分析法檢測(cè)水產(chǎn)致病菌[D]. 顧宏杰.集美大學(xué) 2015
[2]UCH-L3基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在雷帕霉素誘導(dǎo)的NCI-H460細(xì)胞自噬中的作用的研究[D]. 姚冰潔.大連醫(yī)科大學(xué) 2013
[3]嗜水氣單胞菌成膜相關(guān)基因鑒定及其功能研究[D]. 毛秀秀.集美大學(xué) 2011



本文編號(hào)：3423836