發(fā)布時(shí)間：2021-09-08 11:25

　　滇池金線(xiàn)魚(yú)巴（Sinocyclocheilus grahami, S. grahami）是云南的名貴水產(chǎn)之一,具有良好的食用和藥用價(jià)值。20世紀(jì)中期,滇池金線(xiàn)鲃是滇池中非常重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi),但由于生存環(huán)境的惡化和過(guò)度捕撈,該物種已被列為國(guó)家Ⅱ級(jí)保護(hù)動(dòng)物,并被列入《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)·魚(yú)類(lèi)》。本研究中對(duì)滇池金線(xiàn)鰓肌肉組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,并對(duì)其中一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)行表達(dá)和性質(zhì)研究。主要研究成果如下：1.本文利用Hiseq 2500測(cè)序平臺(tái)對(duì)滇池金線(xiàn)鲃肌肉組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,經(jīng)過(guò)DENOVO組裝、功能注釋、CDS預(yù)測(cè)以及分析,共預(yù)測(cè)了22916條蛋白質(zhì),其中包含大量尚未見(jiàn)報(bào)道的滇池金線(xiàn)鰓所特有的蛋白質(zhì)信息,包括重要的生物活性分子如抗菌肽、抗氧化肽、蛋白酶抑制劑,為我們研究其重要的生物活性肽性質(zhì)和功能提供了基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得了滇池金線(xiàn)鰓生長(zhǎng)發(fā)育、免疫應(yīng)答等眾多生理活動(dòng)以及進(jìn)化過(guò)程基因轉(zhuǎn)錄的信息。為深入研究滇池金線(xiàn)鰓的種質(zhì)資源、對(duì)抗病原侵害的免疫應(yīng)答、生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控等諸多課題提供了一個(gè)強(qiáng)大的資源保障。2.半胱氨酸蛋白酶抑制劑（cystatin）作為半胱氨酸蛋白酶可逆抑制劑的一個(gè)超家族,... 

【文章來(lái)源】：昆明理工大學(xué)云南省

【文章頁(yè)數(shù)】：96 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略詞
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 滇池金線(xiàn)鰓概況
    1.2 魚(yú)類(lèi)中半胱氨酸蛋白酶抑制劑研究進(jìn)展
    1.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展
        1.3.1 轉(zhuǎn)錄組學(xué)概念
        1.3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法
        1.3.3 RNA測(cè)序的流程
            1.3.3.1 文庫(kù)構(gòu)建
            1.3.3.2 測(cè)序
            1.3.3.3 生物信息學(xué)分析
    1.4 RNA測(cè)序技術(shù)在魚(yú)類(lèi)中的研究進(jìn)展
        1.4.1 應(yīng)用RNA測(cè)序技術(shù)在魚(yú)類(lèi)中獲得的生物見(jiàn)解
        1.4.2 轉(zhuǎn)錄組映射和基因組注釋
        1.4.3 新的轉(zhuǎn)錄物的發(fā)現(xiàn)
        1.4.4 轉(zhuǎn)錄后修飾(RNA剪接)
        1.4.5 SNP的發(fā)現(xiàn)
        1.4.6 量化轉(zhuǎn)錄水平
            1.4.6.1 發(fā)育生物學(xué)
            1.4.6.2 免疫學(xué)
            1.4.6.3 生理過(guò)程
            1.4.6.4 進(jìn)化生物學(xué)
    1.5 論文選題意義及研究?jī)?nèi)容
第二章 滇池金線(xiàn)鲃的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器
        2.1.3 其他
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 滇池金線(xiàn)鲃肌肉組織的總RNA提取
        2.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序
            2.2.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)
            2.2.2.2 轉(zhuǎn)錄本組裝
            2.2.2.3 Unigene功能注釋
            2.2.2.4 ORF/CDS預(yù)測(cè)
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 滇池金線(xiàn)鲃肌肉組織總RNA質(zhì)量檢測(cè)
        2.3.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果
            2.3.2.1 組裝轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
            2.3.2.2 轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量分布
            2.3.2.3 Unigene功能注釋
            2.3.2.4 ORF/CDS預(yù)測(cè)
    2.4 討論
第三章 滇池金線(xiàn)鲃中Cystatin-J cDNA序列獲得及分析
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        3.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑
        3.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈
            3.2.1.1 滇池金線(xiàn)鲃肌肉組織總RNA的提取
            3.2.1.2 反轉(zhuǎn)錄合成
        3.2.2 滇池金線(xiàn)鲃Cystatin-J序列的獲得
            3.2.2.1 PCR擴(kuò)增Cystatin-J序列
            3.2.2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及目的片段純化
            3.2.2.3 連接反應(yīng)
            3.2.2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            3.2.2.5 陽(yáng)性克隆的篩選及測(cè)序
        3.2.3 滇池金線(xiàn)鰓cyatatin-J序列分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 Cystatin-J序列的獲得
            3.3.1.1 總RNA提取
            3.3.1.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果
        3.3.2 Cystatin-J序列分析
            3.3.2.1 Cystatin-J開(kāi)放閱讀框的獲得
            3.3.2.2 理化性質(zhì)
            3.3.2.3 信號(hào)肽預(yù)測(cè)與糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)
            3.3.2.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析
            3.3.2.5 Cystatin-J三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
            3.3.2.6 多重序列比對(duì)
            3.3.2.7 Cystatin-J蛋白同源物的進(jìn)化分析
    3.4 討論
第四章 滇池金線(xiàn)鲃Cystatin-J的原核表達(dá)、純化及活性檢測(cè)
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑及菌株
        4.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 原核表達(dá)
            4.2.1.1 Cystatin-J基因克隆
            4.2.1.2 Cystatin-J表達(dá)載體構(gòu)建
            4.2.1.3 rCystatin-J重組蛋白的表達(dá)
        4.2.2 rCystatin-J重組蛋白的純化
            4.2.2.1 表達(dá)產(chǎn)物的純化
            4.2.2.2 腸激酶酶切及目的蛋白純化
        4.2.3 重組蛋白rCystatin-J一步法酸純化
            4.2.3.1 不同醋酸濃度對(duì)純化效果的影響
            4.2.3.2 不同處理?xiàng)l件對(duì)純化效果的影響
        4.2.4 rCystatin-J的活性檢測(cè)
            4.2.4.1 抑菌活性檢測(cè)
            4.2.4.2 對(duì)cathepsin B的抑制活性檢測(cè)
            4.2.4.3 Cystatin對(duì)組織蛋白酶B抑制作用的酸堿穩(wěn)定性檢測(cè)
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 原核表達(dá)
        4.3.2 蛋白純化
        4.3.3 重組蛋白酸純化
        4.3.4 Cystatin-J的活性檢測(cè)
            4.3.4.1 抑菌活性
            4.3.4.2 對(duì)cathepsin B的抑制活性檢測(cè)
            4.3.4.3 8μM rCystatin-J在不同pH條件下對(duì)cathepsin B的抑制率
    4.4 討論
第五章 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
附錄A 攻讀碩士期間研究成果
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]滇池金線(xiàn)鲃（Sinocyclocheilus grahami）與撫仙金線(xiàn)鲃（S.tingi）肌肉營(yíng)養(yǎng)成分初步分析[J]. 趙亞鵬,潘曉賦,楊君興,陳小勇,李再云,王曉愛(ài).  動(dòng)物學(xué)研究. 2013(06)
[2]云南滇池瀕危特有種滇池金線(xiàn)鲃人工繁殖初報(bào)(英文)[J]. 楊君興,潘曉賦,李再云.  動(dòng)物學(xué)研究. 2007(03)
[3]滇池土著魚(yú)類(lèi)現(xiàn)狀[J]. 陳自明,楊君興,蘇瑞鳳,陳小勇.  生物多樣性. 2001(04)



本文編號(hào)：3390704