為構(gòu)建歐洲鰻鱺噬菌體天然單鏈抗體（scFv）庫,篩選鰻鱺病原菌特異性scFv,本研究采用PCR擴增健康歐洲鰻鱺重鏈可變區(qū)（VH）與輕鏈可變區(qū)（VL）基因,通過重疊延伸PCR（SOE-PCR）技術(shù)擴增完整的scFv基因（VH-Linker-VL）序列,與T7噬菌體載體連接,經(jīng)體外包裝后接種于宿主菌BLT5403,增殖后經(jīng)PCR擴增獲得噬菌體scFv庫。進而以嗜水氣單胞菌重組外膜蛋白為抗原,對噬菌體scFv庫進行4輪生物淘洗,采用阻斷ELISA選取抗體活性最高的scFv,構(gòu)建pGEX-4T-2-OMP-scFv重組表達載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21進行原核表達。結(jié)果顯示:本研究得到了完整的scFv基因序列,并以此構(gòu)建的噬菌體scFv原始庫容為1.26×10⁶pfu,經(jīng)擴增后初級庫滴度為2.8×10⁹pfu/mL;淘洗獲得的嗜水氣單胞菌重組外膜蛋白scFv抑制率最高達到81.7%,并實現(xiàn)了該scFv在大腸桿菌中的表達,SDS-PAGE檢測其蛋白分子量約為53 ku。本研究構(gòu)建的歐洲鰻鱺噬菌體天然scFv庫及淘選獲得的特異性嗜水氣單胞菌scFv,為養(yǎng)殖鰻... 

【文章來源】：中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報. 2020,42(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

歐洲鰻鱺抗體VH、VL及scFv基因的擴增產(chǎn)物

取3個重復(fù)平板中噬菌斑數(shù)量的平均值，通過公式：滴度（pfu/mL）=對應(yīng)稀釋倍數(shù)的噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×10，計算噬菌體scFv庫滴度。結(jié)果顯示原始噬菌體scFv庫滴度為42×104×10=4.2×106pfu/mL，庫容為4.2×106pfu/mL×0.3 mL=1.26×106pfu（圖2A）；擴增后得到初級噬菌體scFv庫滴度為2.8×109pfu/mL（圖2B）。為進一步驗證原始噬菌體庫中scFv基因序列的插入情況，從原始噬菌體scFv庫的平板中隨機挑取10個噬菌斑，進行PCR擴增，結(jié)果顯示10個噬菌斑均擴增出約750 bp的scFv基因序列（圖3）。表明scFv基因序列同T7 Select10-3b噬菌體載體的連接效率高，噬菌體scFv庫已構(gòu)建。圖3 隨機10個原始噬菌體scFv庫噬菌斑的PCR鑒定

隨機10個原始噬菌體scFv庫噬菌斑的PCR鑒定

【參考文獻】：
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本文編號：3357005