Hepcidin,又稱鐵調(diào)素,是一類重要的抗菌肽,不僅具有廣譜的抗細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞等作用,還是參與機(jī)體鐵調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。本實驗通過PCR技術(shù)獲得了團(tuán)頭魴Hepcidin的cDNA核心序列,并分析了該基因的分子特征及組織表達(dá)特征；采用基因重組技術(shù),將團(tuán)頭魴Hepcidin基因的開放閱讀框ORF區(qū)分別連接到原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體中,得到pGEX-KG-Hepcidin和pPICZaA-Hepcidin重組表達(dá)質(zhì)粒,并且分別在大腸桿菌（BL21）和畢赤酵母（GS115）中誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；對團(tuán)頭魴進(jìn)行嗜水氣單胞菌攻毒試驗,分別在攻毒后4h、8h、12h、24h、48h、72h取樣,檢測肝臟、脾臟、頭腎和前腸組織中Hepcidin基因表達(dá)量的變化。同時測定血清鐵和肝臟組織鐵的變化量。結(jié)果顯示：1.團(tuán)頭魴Hepcidin基因ORF區(qū)為282bp,編碼93個氨基酸,信號肽、前肽和成熟肽分別由24、44、25個氨基酸組成。成熟肽N端有典型的Q-S/I-H-L/I-S/A-L序列,C端有保守的8個半胱氨酸殘基。2.構(gòu)建的pGEX-KG-Hepcidin重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：73 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
縮略語表
氨基酸及其縮寫
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 魚類抗菌肽的研究進(jìn)展
        1.1 抗菌肽的發(fā)現(xiàn)及其特性
        1.2 抗菌肽的抗菌機(jī)理
        1.3 魚類抗菌肽的功能
    2 魚類Hepcidin研究進(jìn)展
        2.1 魚類Hepcidin的基因結(jié)構(gòu)及組織分布
        2.2 魚類Hepcidin對微生物及腫瘤細(xì)胞的活性
            2.2.1 魚類Hepcidin的抗細(xì)菌活性
            2.2.2 魚類Hepcidin的抗病毒活性
            2.2.3 魚類Hepcidin的抗腫瘤細(xì)胞活性
        2.3 魚類Hepcidin的免疫調(diào)節(jié)功能
        2.4 魚類Hepcidin的鐵調(diào)節(jié)功能
            2.4.1 生物體的鐵調(diào)節(jié)
            2.4.2 Hepcidin與鐵調(diào)節(jié)
            2.4.3 Hepcidin與細(xì)菌感染和鐵調(diào)節(jié)
    3 本研究的目的及意義
第二章 團(tuán)頭魴Hepcidin基因的克隆及序列分析
    1 材料
        1.1 試驗魚、菌體與載體
        1.2 主要實驗試劑
        1.3 引物設(shè)計與合成
    2 方法
        2.1 Trizol法提取總RNA
        2.2 cDNA第一條鏈的合成及PCR擴(kuò)增
        2.3 PCR產(chǎn)物回收與純化
        2.4 克隆質(zhì)粒的構(gòu)建與篩選
        2.5 重組克隆質(zhì)粒的PCR鑒定及測序
    3 結(jié)果
        3.1 團(tuán)頭魴肝臟組織總RNA提取結(jié)果
        3.2 團(tuán)頭魴Hepcidin基因的RT-PCR結(jié)果
        3.3 團(tuán)頭魴Hepcidin基因克隆質(zhì)粒的鑒定
        3.4 團(tuán)頭魴Hepcidin基因的序列分析
            3.4.1 團(tuán)頭魴Hepcidin核苷酸序列分析
            3.4.2 團(tuán)頭魴Hepcidin氨基酸序列分析
            3.4.3 團(tuán)頭魴Hepcidin系統(tǒng)進(jìn)化分析
    4 討論
第三章 團(tuán)頭魴Hepcidin基因的原核表達(dá)與真核表達(dá)
    1 材料
        1.1 菌體與載體
        1.2 主要實驗試劑
        1.3 引物設(shè)計與合成
    2 方法
        2.1 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.1.1 目的基因的PCR擴(kuò)增及純化
            2.1.2 表達(dá)載體質(zhì)粒的提取
            2.1.3 目的基因與表達(dá)載體pGEX-KG的雙酶切
            2.1.4 目的基因與原核表達(dá)載體的連接與轉(zhuǎn)化
            2.1.5 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定及測序
        2.2 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)
            2.2.1 原核重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21(DE3)
            2.2.2 原核重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            2.2.3 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析及活性鑒定
        2.3 真核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
            2.3.1 目的基因的PCR擴(kuò)增及純化
            2.3.2 表達(dá)載體質(zhì)粒的提取
            2.3.3 目的基因與表達(dá)載體pPICZαA的雙酶切
            2.3.4 目的基因與真核表達(dá)載體的連接與轉(zhuǎn)化
            2.3.5 重組真核表達(dá)質(zhì)粒的PCR鑒定及測序
        2.4 重組真核表達(dá)質(zhì)粒在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)
            2.4.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Hepcidin的提取及線性化
            2.4.2 酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
            2.4.3 線性化重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至酵母感受態(tài)細(xì)胞
            2.4.4 陽性酵母菌株的篩選及誘導(dǎo)表達(dá)
            2.4.5 誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的體外抑菌實驗
    3 結(jié)果
        3.1 原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            3.1.1 原核重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-Hepcidin的雙酶切結(jié)果
            3.1.2 原核重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-KG-Hepcidin的測序鑒定
            3.1.3 原核誘導(dǎo)表達(dá)蛋白的SDS-PAGE分析及活性分析
        3.2 真核重組表達(dá)載體的構(gòu)建與蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            3.2.1 真核重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Hepcidin的PCR鑒定
            3.2.2 真核重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZαA-Hepcidin的測序鑒定
            3.2.3 陽性重組酵母菌落的PCR鑒定
            3.2.4 酵母誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物抗菌活性鑒定
    4 討論
第四章 團(tuán)頭魴Hepcidin鐵調(diào)節(jié)生物活性的研究
    1 材料
        1.1 供試菌株
        1.2 試驗魚與試驗條件
        1.3 引物設(shè)計與合成
    2 方法
        2.1 實驗分組
        2.2 團(tuán)頭魴Hepcidin基因的組織分布
        2.3 團(tuán)頭魴Hepcidin基因表達(dá)量的變化
        2.4 團(tuán)頭魴肝臟組織鐵含量測定
        2.5 血清鐵含量測定
        2.6 數(shù)據(jù)分析
    3 結(jié)果
        3.1 RNA質(zhì)量的檢測
        3.2 團(tuán)頭魴Hepcidin基因的組織分布
        3.3 團(tuán)頭魴感染嗜水氣單胞菌后Hepcidin基因表達(dá)量的變化
        3.4 團(tuán)頭魴感染嗜水氣單胞菌后血清鐵含量的變化
        3.5 團(tuán)頭魴感染嗜水氣單胞菌后肝臟組織鐵含量的變化
    4 討論
參考文獻(xiàn)
附錄
碩士期間研究成果
致謝



本文編號：3341449