以提取的無乳鏈球菌ATCC51487菌株全基因組為模板,通過PCR擴(kuò)增出srtA_ΔN82基因,經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切、抗性篩選等方法構(gòu)建重組表達(dá)載體,測(cè)定不同誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的影響,利用親和層析和離子交換層析純化蛋白,并使用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法測(cè)定蛋白活性。結(jié)果顯示,試驗(yàn)構(gòu)建的pGEX-6p-1-srtA_ΔN82載體轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）后,在37℃條件下經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)6 h后可得到大量的可溶性蛋白,且純度大于85%。純化后的SrtA_ΔN82與底物作用后,可顯著提高反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度,表明得到的SrtA_ΔN82具有較好的生物學(xué)活性。 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,39(04)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【部分圖文】：

菌液PCR擴(kuò)增電泳圖

為分析srtAΔN82基因在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中是否表達(dá),通過蛋白電泳分析了加入IPTG(1 mmol/L)誘導(dǎo)前后的菌體總蛋白。如圖4所示,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的大腸桿菌在分子質(zhì)量約為42 ku 處有明顯的條帶,而誘導(dǎo)前的菌體在該位置有微弱的表達(dá)條帶,且該條帶的分子質(zhì)量與GST-SrtAΔN82融合蛋白的理論分子質(zhì)量42 ku一致。以上結(jié)果表明,本試驗(yàn)構(gòu)建的pGEX-6p-1-srtAΔN82原核表達(dá)載體在大腸桿菌BL21 (DE3) 中能夠表達(dá)。圖4 SrtAΔN82預(yù)表達(dá)SDS - PAGE電泳圖

圖3 重組載體雙酶切電泳圖為了獲得SrtAΔN82的可溶性表達(dá),試驗(yàn)分析了37 ℃和16 ℃ 2個(gè)溫度下的表達(dá)形式。如圖5所示,16 ℃和 37 ℃條件下細(xì)菌裂解液上清中均有目的蛋白,表明該2種不同溫度下SrtAΔN82均能可溶性表達(dá),且在37 ℃條件下表達(dá)量較高。此外,通過對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間的分析發(fā)現(xiàn),加入IPTG后繼續(xù)誘導(dǎo)6 h可以得到最大表達(dá)量(圖6)。因此,本試驗(yàn)確定的誘導(dǎo)表達(dá)溫度為37 ℃,誘導(dǎo)劑IPTG濃度為1 mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)間6 h。

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