為了解養(yǎng)殖場內(nèi)貽貝的諾如病毒（Norovirus,NoVs）污染情況和基因型分布特點(diǎn),分別于2019年4月和9月在浙江省舟山市枸杞島后頭灣和龍泉村貽貝養(yǎng)殖場近岸和遠(yuǎn)岸區(qū)域進(jìn)行貽貝樣本采集及諾如病毒檢測,共檢測670只貽貝樣本,諾如病毒陽性率約9.9%（66/670）。離人類活動區(qū)域較近的貽貝,諾如病毒陽性率占總陽性率的72.7%（48/66）,遠(yuǎn)岸的貽貝諾如病毒陽性率占總陽性率的27.3%（18/66）。共檢測到6種諾如病毒基因型,分別為GI.3（36.4%）、GI.4（19.7%）、GII.12（18.2%）、GII.17（13.6%）、GII.3（10.6%）和GII.2（1.5%）。研究表明,枸杞島養(yǎng)殖場中諾如病毒污染率較高,涉及基因型較多,人類活動對養(yǎng)殖場內(nèi)貽貝中諾如病毒的富集量具有一定影響。 

【文章來源】：微生物學(xué)雜志. 2020,40(05)CSCD

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【部分圖文】：

龍泉村養(yǎng)殖場第一次采樣貽貝感染諾如

①諾如病毒檢出率:檢測貽貝180只。每個采樣點(diǎn)的樣本檢測情況見表4。其中近岸樣本諾如病毒陽性率為3.9%(7/180),遠(yuǎn)岸貽貝未檢出諾如病毒。②諾如病毒基因型分布:共檢出諾如病毒陽性貽貝7只,覆蓋GI.3(71.4%)和GII.17(28.6%)兩種基因型(圖4)。表4 后頭灣養(yǎng)殖場第二次采樣各采樣點(diǎn)貽貝感染諾如病毒檢測結(jié)果Table 4 The detection result of each sample site for the second time at Houtou Bay 采樣點(diǎn) 采樣數(shù)/只 陽性數(shù)/只 陽性率/% 基因型 GI GII 近岸采樣點(diǎn) A1 10 1 10 0 GII.17(n=1) A2 10 2 20 GI.3(n=2) 0 A3 10 2 20 GI.3(n=1) GII.17(n=1) A4 10 0 0 0 0 A5 10 0 0 0 0 A6 10 0 0 0 0 A7 10 0 0 0 0 A8 10 0 0 0 0 A9 10 0 0 0 0 A10 10 2 20 GI.3(n=2) 0 遠(yuǎn)岸采樣點(diǎn) B1 10 0 0 0 0 B2 10 0 0 0 0 B3 10 0 0 0 0 B4 10 0 0 0 0 B5 10 0 0 0 0 B6 10 0 0 0 0 B7 10 0 0 0 0 B8 10 0 0 0 0

巢式RT-PCR使用諾如病毒GI型引物(COGIF/GISKR和 NGIOF/NGIOR)和GII型引物(COG2F/G2SKR和G2SKF/G2SKR)(見表1)[4,15-16]進(jìn)行,采用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(GI: 168 bp, GII: 343 bp)。參照逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)試劑盒操作說明配制體系,具體反應(yīng)體系如下:取 1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶、12.5 μL 2×RT-PCR 緩沖液、1 μL上、下游GI和GII型引物于PCR 反應(yīng)管中,加入1 μL RNA 模板,RNase-free ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。第一輪RT-PCR程序?yàn)?0 ℃保持 30 min,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,將單鏈 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA(complementary-DNA),94 ℃預(yù)變性2 min,30個循環(huán):94 ℃變性 0.5 min,55 ℃退火0.5 min,72 ℃延伸0.5 min。將第一輪 RT-PCR 的產(chǎn)物稀釋10倍并取1 μL作為Nested-PCR的模板,Nested-PCR反應(yīng)體系如下:取12.5 μL的2×PCR 緩沖液、1 μL上、下游GI和GII型引物(見表1)、1 μL的模板于PCR反應(yīng)管中,ddH2O補(bǔ)足至25 μL。 Nested-PCR反應(yīng)程序如下:94 ℃預(yù)變性5 min,40個循環(huán):94 ℃變性0.5 min,55 ℃退火保持0.5 min,72 ℃延伸0.5 min。最后在72 ℃保溫15 min加poly-A尾,以便進(jìn)行后續(xù)的TA 連接和測序試驗(yàn)。表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study 方法 基因組 引物 核酸序列(5′-3′) 起始位點(diǎn) RT-PCR GI COG1F GGYTGGATGCGNTTYCATGA 5291a GISKR CCAACCCARCCATTRTACA 5671a GII COG2F CARGARBCNATGTTYAGRTGGATGAG 5003b G2SKR CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT 5389b Nested-PCR GI NGIOF TGATGGCGTCTAAGGACG 5362a NGIOR TGAHTATCCAGGGGTCAAT 5529a GII G2SKF CNTGGGAGGGCGATCGCAA 5058b G2SKR CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT 5401b 注:a為引物5′端在序列M87661的位置;b為引物5′端在序列X86557的位置;簡并引物中的混合堿基:Y表示C或T;N表示A或G或C或T;R表示A或G;H表示A或C或T;B表示C或G或T

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]廣東省市售牡蠣中諾如病毒污染調(diào)查[J]. 寇曉霞,吳愛武,范宏英.  現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué). 2018(24)
[2]廣西養(yǎng)殖牡蠣中諾如病毒的污染狀況及風(fēng)險評估[J]. 呂素玲,譚冬梅,姚雪婷,李秀桂.  中國食品衛(wèi)生雜志. 2018(05)
[3]廣東養(yǎng)殖牡蠣的諾如病毒污染狀況調(diào)查[J]. 柯丹楓,張永慧.  中華疾病控制雜志. 2012(10)



本文編號：3302771